分子生物学其它常用实验仪器
1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机
5. 微量取液器
实验一 聚合酶链式反应 （PCR）扩增DNA片段
一．实验目的 二．实验原理 三．实验仪器、材料与试剂
四．实验步骤
五．实验结果与讨论
一．实验目的 掌握PCR反应的原理及技术 二．实验原理 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称PCR技术，是一种体 外扩增特异DNA片段的技术； • 利用PCR技术可在短时间内获得数 百万个特异的DNA序列的拷贝；
⑤ 引物之间： 两引物之间不应有互补性，尤 其避免3’端的互补重叠以防引物二聚体的 形成。 ⑥ 引物的3’端： 引物的延伸是从3’端开始的， 不能进行任何修饰。 ⑦ 引物的5’端：引物的5’端限定着PCR产物的 长度，它对扩增特异性影响不大。因此， 可以被修饰而不影响扩增的特异性。 • 引物5’端的修饰包括：加酶切位点；标记 生物素、荧光等；引入蛋白质结合位点； 引入突变位点、插入与缺失突变序列和引 入启动子序列等。
⑥ 所有试剂都应该以大体积配制，试验一下 是否满意，然后分装成小份以确保实验间 的连续性。 ⑦ 所有试剂或样品准备过程中都要使用一次 性灭菌的塑料瓶和离心管，玻璃器皿应洗 涤干净并高压灭菌。 ⑧ PCR样品应在冰浴上化开，并且要充分 混匀。 ⑨ 扩增反应应当设计不加模板的阴性对照， 电泳时应当加标准DNA分子量标记 （Marker）以估计产物的大小。
五、实验结果与讨论
PCR体系的调制过程中应尽量减少污染的 机会，以免出现目的条带以外的杂带。 • 如退火温度过低，也可能出现杂带。
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使用3 mg的DNA Marker DL 2,000（500 ng/条带）进行1% 的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb， 750bp，500bp，250bp，100bp。
2. 按下述循环程序进行扩增 ① 94℃ 5（3）分钟，1个循环； ② 94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分25秒；30 个循环； ③ 72℃ 延伸10 分钟。 ④ 4℃保温。
3. 扩增结束后，取全部 PCR扩增产物进行1% 的琼脂糖电泳，检测扩增情况、分析结果。 • 并在紫外灯下切割扩增的琼脂糖胶块中的 DNA片段、放入Eppendorf管中。4℃冰箱 存放，用于回收。
1. 琼脂糖 2. TAE电泳缓冲液(50×): Tris 242g ,冰醋酸 57.1ml, 0.5mol/L EDTA（pH8.0）100ml 。 稀释到电泳缓冲液1×TAE 3. 溴化乙锭溶液 10mg/ml，室温下棕色瓶或 铝铂纸包装保存。 4. 10 ×(6×) ×溴酚蓝指示剂（DNA样品加 样缓冲液）
⑩ 琼脂糖凝胶电泳对DNA分子的检测，主要 基于在凝胶中加入溴化乙锭，这样溴化乙 锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物， 使DNA在紫外光下发射很强的荧光，而在 紫外光下DNA发出的荧光是可见光。在溴 化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于 DNA的含量，因而DNA的检测很方便。 • 如将已知大小和浓度的标准样品（Marker） 作电泳对照，就可估计出待测样品的大小 和浓度。
• PCR技术在分子克隆、遗传病的基因 诊断等方面得到了广泛的应用。 PCR技术实际上是在模板DNA、引 物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依 赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 • PCR技术的特异性取决于引物和模板 DNA结合的特异性。
PCR：变性－退火－延伸
PCR
靶DNA的扩增
5’ (a) 引物2 5’ 3’ 5’ (c) 引物2互补链 3’
(d)
3’ 3’ 5’ 引物1 3’
(b)
引物1互补链
5’
新引物
3’ 5’
5’ 3’
(e)
不同长度的链
单位长度的链 5’ 3’ 3’ 5’
(f)
引物2互补链
引物1互补链
(g)
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
反应分为三步：
1. 变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链 DNA； 2. 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在 局部形成杂交链； 3. 延伸： 在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条 件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸 反应。 • 以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为 下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个 引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数 量可达到106-107个拷贝。
⑧ 密码子的简并： 如扩增编码区域，引物3’ 端不要终止于密码子的第三位，因为第三 位容易发生简并，会影响扩增特异性与效 率。 ⑨ 引物的特异性： 引物与非特异扩增序列的 同源性不要超过70%或有连续8个碱基同源。 ⑩ 避免产物的二级结构： 选择扩增片断时最 好避开二级结构的区域。 现在有商品化的或免费的计算机软件程序， 可用来在特定的区域中选择引物序列。在 对所研究基因组全部序列并不完全知道的 情况下，这些程序既方便又实用。
1×TAE配制1 %的 Agrose琼脂糖凝胶 液 • 加热，使琼脂糖完全溶解； • 待Agrose琼脂糖凝胶液稍凉（约60℃） 后，加入 约1/1000的1 mg/ml溴化乙锭溶 液（至终浓度为0.5-1 μg/ml）后轻轻混 匀，勿起气泡（避免剧烈摇晃产生气 泡）； • 等溶液降温到50-55℃左右（不烫手）， 将其倒入电泳槽，迅速在制胶槽一端插 上梳子，检查有无气泡。
PCR技术的参数主要有7个：聚合酶、 引物、dNTPs、反应buffer、二价离子、 模板、一价离子。
三、实验仪器、材料与试剂
（一）仪器 1. PCR仪 2. 台式离心机 3. 微量取液器 4. 紫外荧光观测仪 5. 高压灭菌的微量离心管 6. DNA扩增系统 7. 琼脂糖凝胶电泳系统
（二）材料 模板DNA : 800bp的片段插入在pEASY-T1 载体（或pMD18-T或KS载体) （三）试剂 1. 10×PCR buffer 2. dNTPs ： 2.5mM ×4 3. Taq 酶： 5U/µ L 4. 引物1和2 (M13F, M13R) ： 2μmol/L
在紫外观测仪上观察电泳结果； 根据需要切下DNA条带，放入1.5ml离 心管中，放入4 ℃ （-20℃）冷冻保存， 以备以后的实验用。
附：引物设计原则
① 寡核苷酸引物长度一般为15—30bp. ② G+C含量 G+C含量一般在40%-60%。 ③ 碱基的随机分布： 引物中碱基的分布最好 是随机分布的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的 存在。 ④ 引物自身：引物自身不应存在互补序列， 否则引物自身折叠成发夹结构或引物本身 复性。这种二级结构会因空间位阻而影响 引物与模板的复性结合。
pMD18-T Vector
四、实验步骤
1. 在0.2ml Eppendorf管内配制25μl反应体系： ddH2O： 18.25µ (25-6.75) ×7 l 10×PCR buffer： 2.5µ l×7 dNTPs（2.5mM×4） 2µl ×7 M13-F(10µ M)： 0.5µ ×7 l M13-R(10µM)： 0.5µ ×7 l Taq 酶： 0.25ul ×7 模板： 1µ /每管 l 注：做一管阴性对照，即模板为灭菌的双蒸水
注意事项
① PCR反应是在一个在没有DNA污染的干净环 境中进行。 ② 一般而言，只要能够得到可靠的结果，模板 纯化的方法越简单越好。 ③ 要使用新配制的或适当贮存的未使用过的试 剂或缓冲液来提取核酸，不要使用以前用于 别的样品的试剂。 ④ 所用的所有溶液都应该没有核酸和核酸酶的 污染。配制试剂，操作样品，建立反应和以 后的检测扩增产物过程中最好都使用手套。 ⑤ 所有PCR试剂中使用的水都应该用新鲜蒸馏 的去离子水，高压灭菌后分装备用。