二、双脱氧链终止法
DNA核苷酸序列分析
Sanger 双 脱 氧 链 终 止 法
三、DNA自动测序
采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA 序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四 种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反
应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，
通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光 分子，使之发射出四种不同波长荧光，检测器采 集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。
基因芯片(gene chip)
•DNA芯片(DNA chip) •cDNA芯片(cDNA chip) 是指将许多特定的DNA片段或cDNA片 段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位
面积的支持物上 。
蛋白质芯片
蛋白质芯片(protein chip)
是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点 阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反
DNA自动测序结果举例
遗传修饰动物模型的建立 及应用
The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model
一、转基因技术
转基因技术
采用基因转移技术使目的基因整合入受精 卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子 宫，使之发育成个体。 转基因——被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal)
一个SNP表示在基因组某个位点上一个核 苷酸的变化，可以是转换，也可是颠换。 具有转换型变异的SNP约占SNP总量的2/3， 这是因为胞嘧啶是人类基因组中最易发生 突变的位点，其中大多数是甲基化，可自 发脱氨基形成T。 位于染色体上某些区域的一组相关联的 SNP等位位点称为单倍型，相邻SNPs的等 位位点倾向于以一个整体遗传给后代。
应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统
对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。
3、Taqman技术
在PCR反应系统中加入2种不同荧光标记的探针，它们分别 与两个等位基因完全配对。探针的5’端和3’分别用特殊染料 标记，称为供体－受体染料对或引爆－猝灭染料对。 正常情况下，由于探针5’端荧光基团和3’端猝灭基团紧邻在 一起，供体所发荧光由于其光谱在空间上接近受体染料而被 猝灭，只有当两者分离时才能检测到供体所发出的荧光。 随着PCR的进行，与模板完全配对的探针逐步被TaqDNA聚 合酶的5－3外切活性所切割，致使探针5’端上的荧光基团与 3’端的猝灭基团分离，猝灭效应解除，供体的荧光基团被激 活； 而与模板不能完全配对的探针（代表另一种等位基因）不能 被有效切割，供体荧光基团依然被猝灭。通过相应仪器检测 荧光值的变化，便可进行基因分型。
——目的基因的受体动物
二、核转移技术
核转移技术
即动物整体克隆技术，将动物体细胞
核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，
使之发育成个体，即克隆(clone)。
三、基因剔除技术
基因剔除技术
也称基因靶向(gene targeting)灭活， 有目的去除动物体内某种基因的技术。
四、基因转Leabharlann 和基因剔除技术在 医学中的应用 目前很多机构都在检测SNP，做SNP图，建 立SNP与各种疾病之间的联系，如果得出 某些SNP或某些SNP的特定组合与特定疾病、 特定地区发病人群乃至个别患者有明显相 关性，疾病的诊断和治疗将可以更有针对 性，甚至做到个体化。
SNP的检测技术
传统的SNP检测方法可采用RFLP、PCR－单链 构象多态性(PCR-SSCP)、毛细管电泳及变性高 效液相色谱(DHPLC），但它们只能判断有无， 不能确切知道碱基类型。 基因分型（genotyping）是指利用数据库中已 有的SNP进行特定人群的序列和发生频率的研究， 主要包括基因芯片技术、taqman技术、分子信 标（molecular beacon）技术和焦磷酸测序法 （pyrosequencing）。
建立疾病动物模型
① 单基因决定疾病模型 基因剔除 获得性突变(gain-of-function mutation)
② 多基因决定疾病模型
单核苷酸多态性
single nucleotide polymorphism，SNP
概述
单核苷酸多态性（SNP） 是继限制性酶切片断长 度多态性（RFLP）之后的新一代多态性遗传标记， 自从1994年第一次被提出之后，它渐渐成为与分 子标记有关各领域研究的焦点。
根据分布位臵差异，SNP可分为三类： 基因编码区SNP（cSNP）、基因调控区 SNP（pSNP）、基因间随机非编码区SNP （rSNP） 大多数SNP位于基因组的非编码区，并且 有些位于基因组编码区的SNP所致编码序 列的改变并不影响翻译后的氨基酸序列， 这种SNP对个体的表现型是无影响的。
基因芯片
采用寡核苷酸原位合成或显微打印手段将大量的 DNA片段有序地固定排列在固相支持物如尼龙膜， 玻片等表面形成探针阵列，然后与标记的样品进 行杂交，通过对杂交信号的检测实现快速、高效、 并行的多态信息分析。利用基因芯片技术筛查 SNP是随着近几年芯片技术的快速发展、应用、 普及而建立的一种高度并行性、高通量、微型化 和自动化的检测手段，应用该方法可以寻找新的 SNP位点，并实现SNP位点在基因组中的精确定 位.
SNP的筛查方法
1、PCR-RFLP方法
利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种 或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断， 如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会 出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否有 SNP位点以及出现的碱基替换的类型。该技术应 用的前提是SNP的位点必须含有该限制内切酶的 识别位点，它是SNP筛查中最经典的方法之一.
将这4种探针分别与四种模板链（中央位点 处分别为A、G、T、C）互补配对结合，未 结合时探针均不发荧光（通过荧光共振能 量传递作用），只有探针与模板链完全互 补配对时构象才会由U型变为直线型，从而 发出大量荧光，即便只存在一个碱基的错 配也不会发出荧光，可以通过荧光的颜色 不同，识别出该位点的碱基种类。
5、焦磷酸测序法
由4种酶催化同一反应体系中的酶级联反应， 包括DNA聚合酶、硫酸化酶、荧光素酶、 双磷酸酶，反应底物为APS和荧光素。反应 体系还包括待测序的DNA单链和测序引物。 在每一轮测序反应中，加入一种dNTP，如 该dNTP与模板配对，聚合酶就可以催化该 dNTP掺入到引物链中并释放焦磷酸基团 （ppi）。 掺入的dNTP和释放的焦磷酸的量相等。
从遗传影响，SNP分2种：同义SNP，SNP 所导致的编码序列改变并不影响其所翻译 的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突 变碱基的含义相同；非同义SNP，碱基序 列的改变可使蛋白质序列发生改变，影响 蛋白质的功能。这种改变常常是导致生物 性状改变的直接原因。
但有的SNP位于基因启动子中，导致基因转 录活性的上升或下降，造成该蛋白的表达 量上升或下降，进一步影响其生物学活性。 有些位于蛋白质编码区的SNP可能影响翻译 后关键的功能基团的氨基酸序列，从而影 响蛋白质的功能，最终导致对特定环境或 病因的反应敏感性变化。
强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同
分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同
的DNA片段，将这些片段经电泳分离。 分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放
射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。
该反应的关键在于使DNA的4种核苷酸中，只有 1-2种发生特异性的化学切割反应： 专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯 键的化学试剂有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼 (hydrazine)。 硫酸二甲酯是碱性化学试剂，能使DNA链中鸟嘌 呤的N7和腺嘌呤的N6位发生甲基化，在中性PH 环境中就能使糖苷键发生水解，并引起DNA链的 断裂。在碱性条件下，肼能特异性切割C和T。如 果加入1 mol/L的NaCl，那么，只有C被特异性切 割。
4、分子信标（molecular beacons）法
分子信标 （molecular beacons）法由Tyagi 于1998 年建立。 构建4种分子U型探针，其核苷酸序列除中央位点 处分别为T、C、A、G外，其它完全相同，探针 的5′端分别用四种荧光物质标记:香豆素（发蓝 光）-T，荧光素（发绿光）-C，4甲基蕊香红（发 桔红色光）-A，德州红（发红光）-G，探针的3′ 端均结合4-安息香酸（DABCYL，可淬灭很多荧 光物质发出的荧光，可作为一种常用的淬灭物 质）。
SNP作为第三代遗传诊断标记，近几年被广泛应 用于生物以及医学研究的诸多领域。
单核苷酸多态性是指基因组DNA序列中由 于单个核苷酸（A，G，C，T）的突变而引 起多态性，它是一种单核苷酸的变异。
SNP是基因组中最简单、最常见的多态性形 式，具有很高的遗传稳定性。 SNP在人类的发生频率为1％，估计每300～ 1000bp就有一个SNP，人类大概携带300 万～1000万个SNPs。SNP在基因组中具有高 密度和高保守的特点。
二、双脱氧链终止法
Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱氧链终 止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下： ①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准 确的DNA互补链；②该酶能够用2'，3'--双脱氧核 苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的 3'-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应 中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7， T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC 和一种ddNTP。
核 酸 序 列 分 析
Nucleic Acid Sequence Analysis
核酸序列分析的基本原理
化学裂解法 (Maxam-Gillbert法)
DNA链的末端合成终止法 (sanger法)
一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法)