亲和作用
亲和作用：生物分 特异性
亲和体系
子能够区分结构和 性质非常接近的其
高特异性
抗原-单克隆抗体 荷尔蒙－受体蛋白 核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白
他分子，选择性地
酶－底物、产物、抑制剂
与其中某一种分子
相结合，生物分子
群特异性
免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白 酶－辅酶
间的这种特异性相
凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面
分类
名称
作用原理
应用
免疫亲和色谱
抗原与抗体专一性识别
抗原或抗体
固定化金属亲和色谱 锌、镍离子与蛋白表面组氨酸特异性识别 含有组氨酸的蛋白
染料亲和色谱
染料与蛋白之间的特异性识别
激酶、脱氢酶
核苷酸亲和色谱
核苷酸与蛋白之间的特异性识别
激酶、脱氢酶
凝集素亲和色谱
凝集素与糖之间转移性可逆结合
糖蛋白
蛋白亲和色谱
对 类似的抗体的转移性
免疫蛋白等
操作流程
❖ 找与底物专一可逆结合 的配基；
❖ 将配基通过共价键偶联 到基质；
❖ 配基与底物吸附； ❖ 洗脱目标物。
例子
免疫亲和色谱
❖ 抗原和抗体的作用具有高度的专一性, 并且它 们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将 抗原或抗体结合到吸附剂上, 便可有效地分离 和纯化免疫物质。
条件； 3、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入产品
中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。
影响因素
❖ 上样体积---若目标产物与配基的结合作用较强，上 样体积对亲和色谱效果影响较小。若二者间结合力 较弱，样品浓度要高一些，上样量不要超过色谱柱 载量的5%~10%。
❖ 柱长------亲和柱的长度需要根据亲和介质的性质确 定。如果亲和介质的载量高，与目标产物的作用力 强，可以选择较短的珠子；相反，则应该增加柱子 的长度，保证目标产物与亲和介质有充分的作用时 间。
互作用。
受体 酶、蛋白质-肝素
酶、蛋白质-活性色素（染料）
酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等）
酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等）
基本特点
优点： 1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高； 2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子 3、纯化倍数大，产物纯度高。 缺点： 1、价格相对较昂贵； 2、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析
基因重组融合蛋白的纯化
❖ 流速---亲和吸附时目标产物与配基之间达到结合反应平 衡需要一个缓慢的过程。因此，样品上柱的流速应尽量 的慢，保证目标产物与配基之间有充分的时间结合，尤 其是二者间结合力弱和样品浓度过高时。
❖ 温度---温度效应在亲和色谱中比较重要，亲和介质的吸 附能力受温度影响，可以利用不同的温度进行吸附和洗 脱。一般情况下亲和介质的吸附能力随温度的升高而下 降，因此在上样时可选择较低的温度，使待分离物质与 配基有较大的亲和力，充分地结合；而在洗脱时刻采用 较高的温度，使待分离物质与配基的亲和力下降，便于 待分离物质从配基上脱落。一般选择在4℃进行吸附， 25℃下进行洗脱。
原理
将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基 （也称为配体），与具有大孔径、亲水性的固相载 体相偶联、制成专一的亲和吸附剂，再用此亲和吸 附剂填充色谱柱，当含有被分离物质的混合物随着 流动相流经色谱柱时，亲和吸附剂上的配基就有选 择地吸附能与其结合的物质，而其他的蛋白质及杂 质不被吸附，从色谱柱中流出，使用适当的缓冲液 使被分离物质与配基解吸附，即可获得纯化的目的 产物。
❖ 特点：分离效率高，成本高，而且蛋白质亲 Βιβλιοθήκη 配基不稳定，容易降解。解析方式
❖ 特异性解吸——半抗原置换
❖ 非特异性解吸——调节pH值、加入试剂破坏 氢键、引入离子对、加入表面活性剂、冷蒸馏 水洗涤。
纯化血小板第4 因子(PF4)
❖ 用单克隆抗体亲和色谱从人血小板破碎液中 纯化血小板第4 因子(PF4)。将单克隆抗体Sz95- LgG 与溴化氰活化的Spharose 4B 凝胶连 接成亲和色谱柱, 人血小板破碎液经此亲和色 谱柱上样后, 经洗脱获得PF4。结果表明, Sz95- Sepharose 4B 亲和色谱柱的偶联率为72%, 每1mL血小板破碎液中可以纯化到PF4 18 μg 。
高效液相色谱——亲和色谱
定义
亲和色谱也称为亲和层析，是一种利用固定 相的结合特性来分离分子的色谱方法。亲和 色谱在凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物 质有一定结合能力的分子，并且它们的结合 是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相 互分离。亲和色普可以用来从混合物中纯化 或浓缩某一分子，也可以用来去处或减少混 合物中某一分子的含量。