中图分类号:TQ645.9+9;文献标识码:A;文章篇号:1007-2764(200401-0012-032 大豆蛋白水解液脱苦的研究朱海峰 1 班玉凤 1 周克仲 2(1.沈阳工业大学辽阳校区化工学院,辽阳 111003 (2.辽阳石油化纤公司,辽阳111003摘要:大豆蛋白酶解常常会产生苦味,蛋白质水解物苦味肽的苦味是长期困扰其应用的问题。

本文研究了酶法与微生物法对大豆蛋白水解液脱苦的效果。

结果表明:采用端肽酶黑曲霉酸性蛋白酶(3000u/g与内切酶枯草杆菌碱性蛋白酶(Alcalase 2.4L协同作用水解大豆蛋白可有效降低水解液苦味,并且由酿酒酵母对水解液进一步处理后,大豆蛋白水解液的苦味降至更低。

关键词:大豆蛋白水解液;脱苦;黑曲霉酸性蛋白酶;酿酒酵母大豆蛋白是植物性食物中氨基酸组成比例最合理的蛋白质。

通过水解大豆蛋白制成蛋白肽混合物可以提高大豆蛋白的加工性能、营养性以及生理保健功能。

但水解后,原来处于蛋白质内部的疏水性氨基酸就会暴露出来,使水解产物呈现出一定的苦味,限制了水解产物的最终应用,因此必须将苦味消去。

脱苦的主要方法有选择性分离法、掩盖法、膜分离法、和酶法。

文献中报道的在大豆蛋白水解液中多采用活性炭吸附法或活性炭吸附法与包埋法结合法进行脱苦 [1~2], 但在脱苦过程中营养成分会有所损失。

本文在制取大豆蛋白肽工艺中采用酶法和微生物法来脱除大豆蛋白水解液的苦味。

1 材料与方法1.1 实验原料及药品枯草杆菌(Alcalase 碱性蛋白酶 2.4L :食品级 (酶活力 2.4AU/g ,丹麦 NOVO 公司出品;黑曲霉酸性蛋白酶:食品级 (酶活力 3000u/g,北京房山酶制剂厂出品;大豆蛋白(含水量 7.35%,蛋白质含量 69.6% :市售;酿酒酵母:大连理工大学生化实验室提供; 其它试剂为国产试剂。

1.2 实验仪器精密酸度计:pHS-2型,上海雷磁仪器厂; 台式离心机:80-1型, 江苏省金坛市医疗仪器厂; 超级恒温水浴:501型,上海市实验仪器厂; 水夹套式三口玻璃发酵罐:250ml ,自加工; 磁力搅拌器:78-1型,国华电器有限公司。

收稿日期:2003-10-29作者简介:朱海峰(1970~ ,男,讲师,研究方向为生物酶催化 1.3 工艺流程大豆蛋白→酶解→灭酶→离心→水解液→脱苦→脱色→ 浓缩→喷雾干燥1.4 实验方法1.4.1 酶解反应将大豆蛋白在 105℃下干燥至恒重,称取一定量上述原料加入发酵罐 (置于磁力搅拌器上 , 按照设计的底物浓度向发酵罐中补适量自来水。

连接发酵罐和超级恒温水浴,启动磁力搅拌器和超级恒温水浴,然后在搅拌下以一定方式加入蛋白酶(单酶或双酶进行水解。

水解结束后,水解液经过高温灭活(95℃下加热 5min ,在 4000 r/min的条件下离心 10min ,取适量上清液供分析用,同时小心取出全部残渣经充分干燥后用于测定降解率 HR 。

HR 定义为:(底物投料量-剩余残渣量 /底物投料量。

1.4.2 蛋白质水解度(HD 测定根据文献[3~5]介绍的甲醛滴定法测定。

水解度的定义为在水解过程中打开的肽键占蛋白质肽键总数的百分比。

1.4.3 苦味评分标准产品苦味的鉴定采用感官评价法。

以 20名品尝者 (男、女各 10名, 均为不吸烟者按照下面评分基准进行评分,最后得出平均值来表示苦味程度。

将 Alcalase 水解大豆蛋白 18h 的水解液定为 10分, 取 20ml 水解液 10份, 分别加入 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100ml 的蒸馏水,搅拌均匀, 将其苦味值分别定义为 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2、 1、 0。

1.4.4 大豆蛋白原料蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法测定蛋白质含量,见文献 [5]。

322 结果与讨论文献报道蛋白质酶解过程多采用碱性蛋白酶 [7]。

由于肽键的打开会导致水解液 pH 值下降,因此一般在水解过程都要外加碱以维持水解液的 pH 值,确保酶的最佳活性,从而提高蛋白质的降解率并尽可能降低肽分子量。

但是水解过程中加碱恒pH 值的后果是增加了水解物下游处理过程中脱盐除杂难度,不利于降低产品成本和提高产品纯度。

本文酶解反应都是在没有外加碱的 pH 渐变条件下进行的。

2.1 单酶水解2.1.1 Alcalase水解条件考察了反应温度、酶与底物比、反应时间对 Alcalase 水解大豆蛋白的影响,结果见图 1~3。

图 1温度对 Alcalase 水解性能的影响酶与底物比10μl/g蛋白;底物浓度 60g/l;水解时间 2h Fig.1 Effect of hydrolysis temperature on Performance of Alcalase图 2 酶与底物比对 Alcalase 水解性能的影响底物浓度 60g/l;水解时间 2h;反应温度 70℃ Fig.2 Effect of protease / substrate ratio on hydrolysis performanceof Alcalase反应时间 (h降解率 (%水解度 (%图 3 Alcalase水解大豆蛋白时降解率和水解度随时间的变化底物浓度 60g/l;酶与底物比1 0μl/g蛋白;反应温度 70℃ Fig.3 Progress of soybean protein hydrolysis with Alcalase由以上试验可以看出单酶水解的最佳条件是:温度为 70℃ ,酶与底物比的范围为10~20μl/g蛋白,反应时间为 2h 。

反应温度 (℃降解率 (%水解度 (%2.1.2 温度对酸性蛋白酶的水解性能的影响按同样方法, 在不外加碱的情况下筛选出黑曲霉酸性蛋白酶的水解适宜条件:酶与底物比 2%;底物浓度 60g/l;水解时间 2h 。

温度对酸性蛋白酶的水解性能的影响见图 4。

实验中发现酸性蛋白酶的降解率和水解度随温度变化的趋势不一致。

降解率在 55℃有最大值,而水解度则随温度的提高而单调增加。

这一点与 Alcalase 情况不同。

在黑曲霉酸性酶水解大豆蛋白的条件下,蛋白的降解率很低,这可能是因为酸性酶为端肽酶,不利于打开大分子的缘故。

反应温度 (℃降解率 (%水解度 (%Alcalase 酶与底物比(μ l/g 降解率 (%水解度 (%图 4温度对酸性蛋白酶水解性能的影响Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on Performance of acidic protease2.2 双酶协同水解的条件在不外加碱的情况下大豆蛋白水解过程中水解液的 pH 值不断下降,不利于Alcalase 的水解活性,在 Alcalase 的水解体系中引入外切酶黑曲霉酸性蛋白酶后,因为水解液 pH 值的下降恰好有利于酸性蛋白酶工作,因此采用外切酶黑曲霉酸性蛋白酶与内切酶 Alcalase 碱性蛋白酶协同水解大豆蛋白,不但可降低33水解液苦味, 还可能会提高降解率和水解液的水解度。

我们首先通过正交试验优化了双酶水解大豆蛋白的水解条件。

由于酸性蛋白酶的最高允许使用温度为60℃, 所以下列正交试验中温度点的选择为最高 60℃。

正交试验结果如表 2所示。

按正交表 L 9(34 设计试验表,反应时间为 4h 。

34表 1 正交试验因素水平Tab.1 The factors and levels of orthogonal test水平A温度℃ B E(Alcalase/SC E(酸性酶 /SD 底物浓度 g/l1 50 5 2% 402 55 10 4% 603 60156%80表 2 正交试验结果Tab.2 The results of the orthogonal test实验号A B C D HR(% HD(%1 1 1 1 1 43 17.352 1 2 2 2 44 243 1 3 3 3 44.5 26.414 2 1 2 3 44.25 22.03 5 2 2 3 1 54 22.016 2 3 1 2 46 24.267 3 1 3 2 48 24.37 8 3 2 1 3 43 22.239 3 3 2 1 52.5 23.92HR HD HR HD HR HD HR HD K 1 131.5 67.76 135.25 63.75132 63.84 149.563.28K 2 144.25 68.3 141 68.24140.75 69.95 138 72.63 K 3143.5 70.52 143 74.59146.5 72.79 131.7570.67 k 1 43.83 22.59 45.08 21.2544 21.28 49.8321.09k 2 48.08 22.77 47 22.7546.92 23.32 46 24.21 k 3 47.83 23.51 47.67 24.8648.83 24.26 43.9223.59R 4.25 0.92 2.59 3.61 4.83 2.98 5.91 3.12A 2 A 3B 3 B 3C 3 C 3D 1 D 2从正交试验得到的双酶协同水解的最佳水解条件为:底物浓度 40g/l,水解温度为 60℃, Alcalase 与底物比为15μl/g蛋白,酸性蛋白酶与底物比为 6%。

在此最佳水解条件下,考察了大豆蛋白水解降解率和水解度随时间的变化情况。

结果如图 5所示。

由图 5可见,在使用双酶即在内切蛋白酶的水解体系中引入端肽酶的情况下,在水解 18h 的延长时间里,蛋白质降解率和水解液水解度都随着时间的延长明显增加。

在水解时间达到 18h 时,原料降解率达到了约 76%,水解度达到了约 26%,水解度在达到 24h 时仍呈上升趋势。

以上双酶的水解行为及水解结果与 Alcalase 单独水解行为和水解结果明显不同。

双酶水解的最佳时间确定为 18h 。

图 5 双酶水解大豆蛋白降解率及水解度随时间的变化Fig.5 Progress of soybean protein hydrolysis under double enzymes mode2.3 最佳水解条件下 Alcalase 单酶水解的苦味值及水解度和降解率单酶水解最佳反应条件:底物浓度 60g/l, 水解温度 70℃, Alcalase 与底物比15μl/g蛋白。

与双酶水解对照,水解时间取为 18h 。

大豆蛋白降解率为 51%,水解液水解度为 11%。

在水解的 18h 里,随着水解时间延长,水解液苦味逐渐加重。

水解 18h 后水解液味很苦,根据苦味评分标准,苦味值定为 10。

2.4 最佳水解条件下双酶协同水解的苦味值在双酶最佳水解条件下, 水解初始, 水解液味苦, 水解 1h 后水解液苦味显著下降, 以后变化不大。