九、丝氨酸羟基的修饰
甲苯磺酰氟（PMSF)可与丝氨酸残基作用。
试剂
醋酸酐 酰基酸酐 醛 N-溴琥珀酰亚胺 碳二亚胺 苯异硫氰 四硝基甲烷
三硝基苯磺酸
焦碳酸二乙酯 碘乙酸 环乙烯亚胺 甲苯磺酰氟 马来酰胺
常用重要修饰剂的专一性
修饰的侧链
Lys Glu Cys Arg Ser His Tyr Trp Met
O
（三）可被光活化的试剂
N-琥珀酰胺-3-（2-吡啶二硫 代)丙酸酯
这类试剂是异型双功能试剂的扩展。
当交联剂一端的反应基团与蛋白质作用之后，经光照另一端则产 生一个反应活性部分，这部分即可是碳烯，也可是氮烯。
这类交联剂一端一般含有能与氨基或巯基反应的基团，而另一端 则含有对光敏感的基团。
三、交联剂的使用
二、交联剂的类型
交联剂 类型
同型双功能试剂 异型双功能试剂 可被光活化试剂.
可裂解性 不可裂解性
反应基团
间隔基团
反应基团
CH3 O C NH2
亚氨酯
SS N
同型双功能试剂
(CH2)n，长度可变
异型双功能试剂
（-S--（CH2）n-）2
OHO （ CH C ）2
CH3 O C NH2
可被硫醇裂解 长度可变
（二）异型双功能试剂
这类试剂的一端与氨基作用，另一端与巯基侧链作用，但用碳二 亚胺时，另一端反应基团是羧基。
这类交联剂的一端含有氨基反应部分，N-羟琥珀酰亚胺，另一 端含有巯基反应部分，马来酰亚胺或联硫基。
O
O
(CH2)3 C O N
O
N-羟琥珀酰亚胺辛二酸酯 （非裂解）
2
O
O
S S (CH 2)2 CON N
蛋白质与交联剂的反应直接有助于蛋白质构象的稳定性
能形成分子间的交联键，使蛋白质对变性稳定。 两种酶通过交联形成杂化酶。 交联可提高酶分子构象的稳定性。
交联剂可用来测定蛋白质亚基的量
可测定齐聚体蛋白质的分子量和亚基数目。 测定蛋白质上残基间的距离。 测定酶的活性部位。
第五节 亲和标记
亲和标记：部位专一性标记，是利用酶和底物的亲和性， 使用与酶底物类似的修饰剂，对酶活性部位上的氨基酸 残基进行共价标记。 亲和试剂作为底物类似物的标准：
OC
NHR
重排
O
ENZ C
O
NR C
+H+
NHR
E N ZC H
O H + C(NO2)4
四硝基甲烷
八、甲硫氨酸甲硫基的修饰
ENZCH
OH
3-硝基酪氨酸 NO2
+ -C (N O 2)3+H +
用H2O2和过甲酸可将甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亚砜，用碘乙酸 烷化甲硫氨酸残基，能形成正甲硫盐。
吗啉型加合物
过碘酸氧化的ATP（O-ATP）与赖氨酸侧链的可能反应
NH2
NH2
N
N
N
N
OO O
NN
O P O P O P O CH2 O
+ENZ-CH2SH
NN
RO CH2 O
OO
O H C C H 与巯基反应
OO
O-ATP
HO CH C H SO
CH2 ENZ
过碘酸氧化的ATP（O-ATP）与巯基侧链的可能反应
交联剂 同型双功能试剂 分为 异型双功能试剂
（二）交联距离
随着交联剂两个功能基之间距离跨度的增加，形成交联的可能性 也随之增加。
（三）可裂解性
研制可裂解交联剂有助于分离和表征交联片断。
（四）反应活性部分
可以在某种程度上控制交联剂的反应部位，可以通过交联剂反应 活性部位的疏水性、亲水性或电荷来控制反应。
可被高碘酸裂解
OH N3
光活化双功能试剂
能与胺反 应的基团
CON
N CF3 C
（一）同型双功能试剂
能与巯基反 应的基团
O C Cl
交联剂两端具有相同的反应活性部分。
双亚氨酯，可与氨基反应。两端间的间隔基团是（CH2）n
N H 2C l N H 2C l 双亚氨酸酯（非裂解）
C H 3O C(C H 2)n CO C H 3
NH2
过碘酸氧化的ATP（O-ATP）
与氨基侧链的可能反应
NH2
N
N
N
N
O
NN
O P O CH2 O
O
OH OH
NH2
IO4-
OO O
NN
O P O P O P O CH2 O
OO
O
+ENZ-(CH2)4-NH2
与氨基反应
HC CH OO
O-ATP
NH2
N
N
N
N
NN RO CH2 O
NaBH4
NN RO CH2 O
H 2C C H 2 HN OH
(C H 2)4E N Z
HC CH
希夫碱化合物 N O
(C H 2)4E N Z
NH2
N
N
NH2
N
N
OO O
N
O P O P O P O CH2 O
N
+ENZ-(CH2)4-NH2 R O C H 2 N O N
OO
O
H C C H 与氨基反应
OO
O-ATP
HO N OH (C H 2)4EN Z
×
×
×
×
×
×
×
×
××
×
×
×××
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
第四节 蛋白质肽链的交联
双功能试剂：具有两个反应活性部位，可以在相隔较近的两个氨 基酸残基间搭桥、形成多肽链内、多肽链间或者蛋白质分子之间 的交联，而不引起蛋白质构象的重大改变的试剂。
一、设计或选择交联剂要考虑的因素 （一）反应的专一性
9蛋白质的化学修饰
三、羧基的修饰
用水溶性碳二亚胺作催化剂，通过胺专一地修饰蛋白质中的羧 基。
O ENZ C
O
NR
+ C + H+
+N HR
碳二亚胺
O
ENZ C
N + HR
OC
NHR
O
ENZ C
N + HR
OC
+ HX
NHR
O
N +HR
ENZ C X
+
OC
+H+
NHR
形成相应酰胺
OБайду номын сангаас
ENZ C
N + HR
1.在使蛋白质不可逆失活以前，亲和试剂要与酶形成可逆复合物；
2.亲和试剂的修饰程度是有限的； 3.没有反应性的竞争性配位体的存在，应减弱亲和试剂的反应速 度； 4.亲和试剂的体积不能太大，否则产生空间位阻；
5.修饰产物应当稳定，便于表征和定量。
亲和试 剂分类
内生亲和试剂 外生亲和试剂
一、内生亲和试剂
若间隔基团含有二硫桥，则成为可裂解同型双功能试剂。
N H 2 C l
N H 2 C l 二甲基-3，3′-二硫代-
C H 3O C ( C H 2 ) 2SS( C H 2 ) 2C O C H 3双丙基亚氨酯（可裂解）
所有同型双功能试剂都对氨基有专一性，但戊二醛例外，它 除了与氨基反应外，还可与羟基反应。
缺点：产生的二醛几乎全部与赖氨酸侧链反应，不能与 更多类型侧链反应。
嘌呤核苷酸的烷基卤化衍生物也可看作是亲和试剂，各种亲和
侧链如Cys、His、Lys、Met等能与试剂上的卤原子反应。
OO O AdenCH 2 OPOPOPO H