分子生物学实验报告----绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和纯化一、实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。

它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。

GFP由3个外显子组成，长2.6kb；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为27.0 kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。

1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。

发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成。

1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。

实验使用的EGFP蛋白取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋白质编码序列。

此质粒原本被设计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进行表达。

本质粒主要包括位于PCMV真核启动子与SV40 真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与位于EGFP上游的多克隆位点；一个由SV40 早期启动子启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动子可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。

在EGFP编码序列上下游，存在特异的BamH I及Not I限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。

表达EGFP 蛋白使用的pET-28 原核载体包含有在多克隆位点两侧的His-tag polyHis 编码序列；用于表达蛋白的T7 启动子，T7 转录起始物以及T7 终止子；选择性筛选使用的lacI 编码序列及卡那霉素抗性序列，pBR322 启动子，以及为产生单链DNA 产物的f1 启动子。

二、实验目的掌握一种最常用的质粒DNA提取方法，用于从小量培养物中抽提质粒DNA，比较方便、省时，提取的质粒DNA质量较高，可用于DNA的酶切、PCR甚至测序，的DNA碱裂解法。

并利用核酸蛋白测定仪测算核酸的浓度和纯度。

学习掌握琼脂糖凝胶电泳这种最常用的分离、鉴定、纯化DNA片段的基本原理和操作方法。

使用限制型内切酶进行DNA酶切。

了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作要点，以及质粒DNA转化大肠杆菌细胞的原理和方法。

掌握菌落PCR法鉴定重组质粒DNA，了解菌落PCR法鉴定菌落及保存的操作方法。

学会用IPTG阻遏蛋白诱导GFP基因表达。

三、实验原理1、质粒DNA的分离与纯化质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。

迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链DNA分子，分子量范围从1kb到200kb。

质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

在大多数情况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的。

有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达10-200个拷贝。

当宿主细胞的蛋白质合成受到抑制时（例如经氯霉素处理），细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒DNA可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。

质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒DNA用人为的方法转化进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。

借助转化菌获得的新表型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。

质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分子。

目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质粒DNA的分离；质粒DNA的纯化。

（1）细菌的生长和质粒的扩增从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。

对于松弛型质粒（如pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或2YT培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA。

但对于严谨型质粒（如pBR322）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。

（2）菌体的收集、裂解和质粒DNA的分离质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：（1）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。

（2）从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子。

这里主要介绍碱裂解法的基本原理：在细菌悬浮液中加入SDS（十二烷基硫酸钠）和NaOH 使菌体裂解（有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁）。

此处理可破坏碱基配对，故可使细菌的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。

当条件恢复正常时（如加入酸性的NaAc或Kac中和碱性NaOH），质粒DNA链迅速得到准确配对，重新恢复成天然的超螺旋分子。

通过离心，可以使染色体DNA与变性蛋白质、RNA分子一起沉淀下来，而质粒超螺旋分子仍滞留于上清中。

（3）质粒DNA的提纯对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余蛋白质及RNA，达到纯化的目的。

质粒DNA分子具有三种构型：共价闭合环形DNA（cccDNA，SC构型）、开环DNA（OC 构型）和线性分子（L构型）。

在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。

在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。

其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA。

2、质粒DNA浓度的测定核酸分子在260nm下有最大吸光值，因此可以通过260nm下核酸的吸光值计算核酸浓度（mg/ml），并通过测定与280nm和230nm的比值，估算DNA的纯度。

3、琼脂糖凝胶电泳影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素主要有：（1）DNA分子的大小：双链DNA 分子在凝胶基质中迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。

分子越大，迁移的越慢，因为摩擦阻力越大，也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。

（2）琼脂糖浓度：给定大小的线状DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。

在DNA电泳迁移速率的对数和凝胶浓度之间存在线性相关。

（3）DNA的构象：超螺旋环状（℃型）、切口环状（℃型）和线状（℃型）DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。

其相对迁移速率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，其次是电流强度、缓冲液离子强度和℃型超螺旋绞紧的程度或密度。

一些条件下，℃型DNA比℃型迁移得快；在另一些条件下，顺序可能相反。

（4）所用的电压：低电压时，DNA片段迁移率与所用的电压成正比。

电场强度升高时，高分子量片段的迁移率遂不成比例的增加。

所以，当电压增大时琼脂糖凝胶分离的有效范围反而减小。

要获得大于2kb DNA 片段的良好分辨率，所用电压不应高于5-8V/cm 。

（5）电泳缓冲液：DNA 的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。

缺乏离子则电导率降低，DNA 或者不动或者迁移很慢。

高离子强度时（如10×buffer ），电导率升高，使得应用适中的电压也会产生大量的热能，最严重时凝胶会熔化，DNA 变性。

4、酶切及连接迄今已发现了3000多种限制性内切酶。

传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。

II 型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA 链。

它们产生确定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA 分析和克隆的一类。

II 型限制性内切酶中最普遍的是象EcoR I 、Hind III 、BamHI 和Not I 这样在识别序列中进行切割的酶。

这一类酶是构成商业化酶的主要部分。

大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA 上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA 上，识别非对称序列。

一些酶识别连续的序列（如EcoR I 识别GAATTC ；Hind III 识别AAGCTT;BamHI 识别G↓GATCC; Not I 识别GC↓GGCCGC ）；而另一些识别不连续的序列（如Bgl I 识别GCCNNNNNGGC ）。

限制性内切酶酶切DNA 后形成两种类型的末端：(i)两条链断裂的位置是交错地，产生粘性末端，如EcoR I 酶切后产生末端；(ii)两条链的断裂位置处在一个对称结构的中心，产生平末端，如HaeIII 酶切后产生DNA 连接酶能够催化在两条DNA 链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条DNA 链的3’-末端具有一个游离的羟基（-OH ），和在另一条DNA 链的5’-末端具有一个磷酸基团（-P ）。

5、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化外源DNA 只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增。

感受态指细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。

大肠杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生：将正在生长的大肠杆菌细胞在0℃下加入到低渗的CaCl2溶液中，便会使细胞膜的透性发生改变，5’-G ↓AATTC-3’ 3’-CTTAA ↓G-5’ 5’-GG ↓CC-3’ 3’-CC ↓GG-5’。

ligas e 5’ 3’ 5’ 3’此时的细胞即呈现为感受态。

这一方法可以用于批量制备感受态细胞，其转化效率可达到5×106-2×107个转化克隆子/μg超螺旋质粒DNA。

制备好的大肠杆菌感受态细胞可在-70℃冻存。

在0℃下外源DNA可吸附到感受态细胞表面，短时间的热刺激（42℃，90s）诱导细胞吸收DNA。

转化了质粒DNA的大肠杆菌随后在培养基中37℃培养1hr，可使质粒DNA中编码抗生素抗性的基因得以表达，因此，转化了质粒DNA的大肠杆菌细胞可在含有相应抗生素的培养基上生长，而没有转化的细胞则无法生长。

6、重组质粒DNA的鉴定——菌落PCR法单菌落或提取的质粒DNA也可以通过PCR方法鉴定正确克隆。