操作流程
1. 使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶,然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
2. 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸尽凝胶表面的液体。
此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶,尽量减小凝胶体积,提高DNA回收率。
胶块超过300 mg时,请使用多个Column进行回收,否则严重影响收率。
注)切胶时请注意不要将DNA 长时间暴露于紫外灯下,以防止DNA损伤。
3. 切碎胶块。
胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块溶解时间,提高DNA回收率。
4. 称量胶块重量,计算胶块体积。
计算胶块体积时,以1 mg=1 μl 进行计算。
5. 向胶块中加入胶块溶解液Buffer GM,Buffer GM的加量如下表:
凝胶浓度Buffer GM使用量
1.0%3个凝胶体积量
1.0%~1.5%4个凝胶体积量
1.5%~
2.0%5个凝胶体积量
6. 均匀混合后室温15-25℃溶解胶块(胶浓度较大或比较难溶时可以在37℃加热)。
此时应间断振荡混合,使胶块充分溶解(约5~10分钟)。
7. 当凝胶完全溶解后,观察溶胶液的颜色,如果溶胶液颜色由黄色变为橙色或粉色,向上述胶块溶解液中加入3 M醋酸钠溶液(pH5.2)10 μl,均匀混合至溶液恢复黄色。
当分离小于400 bp的DNA片段时,应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。
8. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
9. 将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中,12,000 rpm离心1分钟,弃滤液。
注)如将滤液再加入Spin Column中离心一次,可以提高DNA的回收率。
10. 将700 μl 的Buffer WB加入Spin Column中,室温12,000 rpm离心30秒钟,弃滤液。
注)请确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100%乙醇。
11. 重复操作步骤10。
12. 将Spin Column安置于Collection Tube上,室温12,000 rpm离心1分钟。
13. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上,在Spin Column膜的中央处加入30 μl 灭菌蒸馏水或Elution Buffer,室温静置1分钟。
注)将灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。
14. 室温12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。