动物医学进展,2010,31(S):2082212Progress in Veterinary Medicine猪流感病毒分子生物学研究进展余　华(四川出入境检验检疫局,四川成都610041) 摘　要:猪流感病毒主要引起一种急性高度接触传染性的群发性呼吸道疾病。

论文主要论述了猪流感病毒分子生物学特性、基因组结构及其功能等方面的研究进展。

关键词:流感病毒;猪;分子生物学中图分类号:S852.659.5文献标识码:A文章编号:100725038(2010)0420208205 流感病毒根据M蛋白和N P蛋白的分型差异可分A、B、C3个型,猪流感病毒属于A型流感病毒,为正黏病毒科流感病毒属成员,其基因组由分节段单股负链的RNA组成[1]。

根据遗传特性和抗原性的不同,A型流感病毒到目前为止已至少有16种亚型血凝素和至少9种亚型神经氨酸酶被发现[224],已发现的猪流感病毒至少有H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6、H9N2等7种不同血清亚型。

其中,广泛流行于猪群中的主要有古典型猪H1N1、类禽型H1N1和类人型H3N2毒株。

猪流感病毒主要引起的一种急性高度接触传染性的群发性呼吸道疾病,临床以突发高热、咳嗽、呼吸困难、衰竭、高发病率、低死亡率为特征。

纯SI的病理变化主要表现为病毒性肺炎及其他呼吸器官的炎性变化,有其他病原继发或混合感染时,病理变化会严重而复杂[5]。

研究表明:猪的种间屏障相对较低,是禽、猪、人流感病毒唯一的共同易感宿主,是人流感病毒和禽流感病毒(A IV)双重感染的“混合器”或活载体。

一个细胞同时被两种流感病毒感染,导致基因重配的偶然发生。

从而产生抗原性改变的混合型流感病毒重组株,引起新的大流行。

1976年1月,美国新泽西州佛迪狄克斯5名新兵因感染猪源H1N1病毒而死于肺炎的事件[6],赋予SIV全新的公共卫生意义。

1　猪流感病毒分子生物学特性SIV基因组为分节段的,负链RNA,基因组在转录和复制过程中易于发生基因重排。

宿主细胞没有SIV复制所必需的依赖RNA的RNA复制酶和依赖RNA的RNA转录酶,因此这两种酶都是由自身基因编码的。

这两种酶在复制和转录过程中的忠实性不及DNA聚合酶和转录酶,这决定了病毒在复制和转录过程中有较高变异性。

事实上也是如此,SIV最显著的生物学特性就是变异频族,血清亚型众多。

A IV在两个方面进行变异—抗原漂移(drift)和抗原转变(shift)。

抗原漂移是基因组的点突变,特别是HA和NA的点突变造成HA和NA 较小范围的抗原性改变。

抗原转变则是由于基因组的大片段缺失和插入,造成抗原性较大的改变,以至于出现新亚型毒株和毒株毒力的变异[728]。

下面就猪流感病毒墓因组结构特征,编码蛋白的功能及其相互作用,流感病毒基因工程及其在猪流感病毒研究中的应用等做一概述。

2　猪流感病毒基因组结构及其功能A型流感病毒基因组为单股负链分节段的RNA,共有8个片段,片段126编码单基因产物,片段7、片段8分别编码两种蛋白,片段7编码基质蛋白Ml、M2;片段8编码非结构蛋白NS1,8个基因片段的3末端和5末端都有保守的核苷酸序列,末端13个核普酸序列是3′2GGAACAAA GAU GA PPP2 5′,3末端的核普酸序列是3′2O H2UC GU/CU UU2 C GUCC25′[7]。

在这些共有序列中有些可反向互补。

遗传学和生化试验证实在3′和5′末端保守序列是病毒转录的重要的核昔酸识别位置,这些序列的内部互补性对体内体外的最佳转录是至关重要的。

另外,这些末端序列也是激活流感病毒多聚酶的内切酶活性,切下宿主成熟mRNA帽子结构到病毒前体mRNA上所必需的。

转录体病毒基因表达也进一步阐明末端保守序列在病毒基因表达过程中起着重3收稿日期:2010203227作者简介:作者简介:余　华(1978-),男,四川人,硕士,主要从事动物及动物产品的出入境检验检疫工作。

要的功能。

2.1　血凝素血凝素(hemagglutinin,HA)是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一,为75ku的糖蛋白。

HA 在病毒吸附及穿膜的过程中起关键作用,可刺激机体产生中和抗体,HA在感染过程中可被水解为两条肽链HA1和HA2是感染细胞的先决条件[9210],另外HA的变异性很强,是病毒发生抗原变异的主要原因。

近年的研究证明HA也参与病毒宿主谱的识别,在决定病毒宿主范围方面扮演了一个重要角色。

有关禽流感病毒HA基因在抗原变异、决定病毒致病力和宿主范围方面的作用,陈化兰等和崔尚金等都做了详细的综述,在此不再赘述。

HA由片段4编码,是典型的Ⅰ型蛋自[11]。

它含有4个结构区域:信号肽(前导序列)、胞浆域、跨膜域和胞外域。

用免疫学和生物学方法研究证明,HA在细胞内质网合成,合成后由内质网运送到高尔基体,最后到达细胞膜,嵌入胞膜的脂质双层,在病毒出芽释放时被带到病毒囊膜上[12]。

HA在运送过程中经过不断的修饰,如将N葡萄糖昔寡糖加到天门冬酞胺残基上。

有些寡糖加上去后还经过进一步修饰。

修饰的位置随毒株不同而有区别,这样形成的单体HA分布在内质网上,在向高尔基体运送过程中,由二硫键连接并折叠形成一定的形状,随后形成三聚体,由高尔基体运送到细胞膜[13]。

HA产生后到其发挥作用时,还经过几个切割加工过程,包括N端信号肤的切除及HA1的产生。

N端的信号肽大约有16个氨基酸残基组成,其作用是识别内质网,HA合成后信号肽酶将这一短肽切除,成熟的HA不含信号肽。

另一个加工过程是将HA切割成两条多肽链,产生HA1和HA2切割时去掉一个或多个氨基酸残基,这与宿主细胞及毒株的毒力有关。

HA I和HA2的分子质量分别为36ku和27ku,两条肤链被一个二硫键连在一起,再加上分子内的一些二硫键及其他非共价键的相互作用,使HA形成一定的立体结构。

通过X线晶体衍射技术,对HA的三级结构己经搞清。

2.2　神经氨酸酶神经氨酸酶(neuraminidase,NA)也构成病毒囊膜的纤突,其数量没有HA多,并且呈簇存在。

NA 是一种糖苷外切酶,可以从a2糖苷键上除去唾液酸(N2已酞神经氨酸),因此NA能从病毒和感染的细胞上除去唾液酸残基。

这一功能对病毒粒子以及防止病毒粒子聚集是很重要的[14]。

通过对温度敏感突变株NA的研究发现,NA不直接参与病毒的装配和出芽[15]。

NA还与病毒的宿主特异性及病毒的毒力有关,用去污剂、脂溶剂或蛋白水解酶(如胰蛋白酶、枯草菌素、链酶蛋白酶)处理可使NA纤突从病毒粒子上释放下来。

通过电子显微镜观察,可发现释放的NA纤突呈蘑菇状。

除掉去污剂后,这些纤突可通过疏水的茎部聚集在一起玫瑰获样。

链酶蛋白酶处理释放的纤突,具有完整的酶活性和抗原性,但不聚集呈玫瑰花形,分子质量也比用去污剂处理的释放的小。

这些结果表明,蛋白水解酶处理可切去疏水区使其不能聚集[16]。

病毒囊膜上的NA纤突使NA单体形成四聚体,它包括一个盒子状的头部和一个细茎,目前对其头部的三维结构己经搞清。

NA是一种糖蛋白,其蛋白部分由片段6编码。

目前对绝大多数亚型毒株的片段6序列已经清楚,并能从基因序列推测出其氨基酸序列。

通过对去污剂处理后释放的NA进行部分氨基酸序列分析,发现与根据基因推测的序列很一致。

NA蛋白质序列的特点是翻译后不经过切割;信号肤不被除去:翻译起始用的Met仍然存在;梭基端也不曾经过加工。

从基因序列推测出的氮基端序列位2甲硫氨酸2羟脯氨酸2异亮氨酸。

通过对NA进行测序,证明这一序列仍然存在。

2.3　核蛋白核蛋白(nucleop rotein,N P)是一种单体磷酸化的多肤,分子质量60ku,它是病毒核衣壳的主要蛋白成分[17]。

核蛋白具有型特异性,根据其抗原性的不同,可将流感病毒分为A,B,C型[18219]。

A型流感病毒的核蛋白由片段5编码,有2种形式,一种是可以移入核内的磷酸化形式(N P256),另一种是一直留在细胞质内的非磷酸化(N P253)的形式[20]。

A/ PR/8/34的N P由498个氨基酸残荃组成,富含精氨酸(Arg)。

A型流感病毒的N P序列与B型的有38%的同源性,与C型的有22%的同源性。

核蛋白是一种多功能的蛋白质,除了形成病毒的核衣壳外,可使vRNA形成RN P复合体以此来稳定vRNA,使其免受RN Ase作用,另外在病毒基因组的转录和复制也起作用,在确定病毒的宿主特异方面也有作用[21]。

核蛋白的磷酸化取决于宿主,与流感病毒的宿主谱有关。

N P是细胞毒性淋巴细胞识别的主要抗原,至少具有3个独立的抗原位点。

通过用单克隆抗体和多克隆抗体进行研究,发现在所有被测毒株都有一个共同位点,针对这一位点的单抗能抑制病毒RNA分子体外转录。

针对核蛋白的单克隆抗体不能给动物提供保护,用提纯的核蛋白免疫动物,也可能产生很微弱的抗感染能力[22]。

902余　华:猪流感病毒分子生物学研究进展2.4　基质蛋白流感病毒的基质蛋白(mat rix proteins)由病毒基因组片段7编码[23]。

片段7有两个读码框,可转录出两个mRNA,分别翻译出一种蛋白质。

因此流感病毒的基质蛋白有两种,即M1和M2。

M1由252个氨基酸残基组成,分子质量约26ku,它是病毒的主要结构蛋白,占流感病毒蛋白总量的40%[24]。

这种蛋白也具有型特异性,其抗原性的差异是流感病毒分型的依据之一[25]。

Ml位于病毒囊膜的类脂双层内侧、核衣壳的外侧,维持病毒形态的结构蛋白。

另外Ml还可在感染细胞的细胞核、细胞质和细胞膜上发现[26]。

研究表明M1的氨基端含有一亲水区,狡基端与病毒的转录酶之间有相互作用[27]。

流感病毒的M1具有多种功能,除维持病毒粒子的形态外,还调节病毒转录酶的活性,另外在子代病毒粒子装配方面也起重要作用。

据报道,M1单克隆抗体不能给动物提供被动保护。

M1不被糖基化,作为病毒的负调控基因,还与转录酶有关[28]。

M2由97个氨基酸残基组成,分子质量大约为15 ku,由片段7转录的第一个小mRNA翻译。

M2也是一种跨膜粒子通道蛋白,主要以四聚体形式存在于感染细胞的细胞膜上,另外也是病毒囊膜上的蛋白组分之一。

每个病毒粒子大约含有14268个M2分子[29]。

流感病毒M2的主要作用是,在HA合成过程中作为质子通道控制高尔基体内的P H值;在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境;另外在病毒装配过程中也起作用[30]。

研究表明,针对M2氨基端的单克隆抗体可抑制病毒蚀斑的增大,其作用方式与抗神经氨酸酶抗体的作用方式相同[31]。

用这种单抗筛选突变株时,不仅引起M2的突变,还能引起M I的突变。

流感病毒M2的氨基酸序列很保守,在所检测的毒株中,其同源性高达90%[32]。

这种蛋白在感染细胞的细胞膜上与I类糖蛋白相似,即氨基端在细胞外,狡基端在细胞内。