实验一还原糖和总糖含量的测定
欧阳光明（2021.03.07）
（3,5-二硝基水杨酸比色法）
一．目的
1.掌握还原糖定量测定的基本原理；
2.学习比色定糖法的基本操作；
3.熟悉分光光度计的使用方法。

二．原理
在碱性的条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质）,还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别样品中还原糖和总糖的含量。

三．仪器.试剂和材料
1.仪器：
（1）25ml刻度试管（2）玻璃漏斗（3）三角瓶（4）100ml 容量瓶3个（5）刻度吸管（1ml,2ml,3ml）（6）恒温水浴（7）沸水浴（8）电子天平（9）分光光度计
2.试剂；
（1）1mg/ml葡萄糖标准液（2）3,5-二硝基水杨酸试剂（3）碘碘化钾溶液（4）酚酞指示剂（5）6ml/L HCI （6）6ml/L NaOH 3.材料：食用面粉
四．操作步骤
1.制作葡萄糖标准曲线：取7支25ml刻度试管，编号，按如下操作。

操作项目管号
0 1 2 3 4 5 6
葡萄糖标准液（ml）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
蒸馏水（ml） 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8
3,5-二硝基水杨酸（ml） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
吸光度（A540）0.000 0.081 0.217 0.331 0.467 0.575 0.648
将各管摇匀，在沸水中加热5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25min，用试管塞塞住试管口，颠倒混匀。

在540nm波长下，用0号试管调零，分别读取1~6号管的吸光度。

以吸光度为纵坐标，葡萄样毫克数为横坐标，绘制标准曲线。

2.样品中还原糖和总糖含量的测定
（1）样品中还原糖的提取：准确称取3g使用面粉，放在100ml 三角瓶中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加50ml蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水中保温20min，使还原糖浸出。

过滤，用20ml蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。

（2）样品中总糖的水解和提取：准确称取1g使用面粉。

放在100ml的三角瓶中，加入10ml 6mol/L HCI及15ml蒸馏水，置于水浴中加热水解30min。

待三角瓶中水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂。

以6mol/LNaOH中和至微红色，过滤，再用少量蒸馏水冲洗三角瓶及滤纸，将滤纸全部收集砸100ml的容量瓶中，用蒸馏水定
容至刻度，混匀。

精确吸取10ml定容过的水解液，移入另一100ml 的容量瓶中，以水稀释定容，混匀，作为总糖待测液。

（3）显色和比色，取4支25ml刻度试管，编号，按下表的量操作。

操作项目还原糖测定管号总糖测定管号
○1○2ⅠⅡ
还原糖待测液（ml） 1 1 0 0
总糖待测液（ml）0 0 1 1
蒸馏水（ml）0 0 1 1
3,5-二硝基水杨酸（ml） 1.5 1.5 1.5 1.5
吸光度（A540）0.303 0.298 0.410 0.414
吸光度（A540）平均值0.301 0.421
五、注意事项：标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。

六、结果处理
（1）由管○1、○2吸光度平均值在葡萄糖标准曲线查出相应的还原糖毫克数为：0.167mg
由管Ⅰ、Ⅱ吸光度平均值在葡萄糖标准曲线查出相应的还原糖毫克数为：0.235mg
（2）计算样品中还原糖和总糖的百分含量如下：
还原糖℅=0.557℅总糖℅=0.235℅
七、问题讨论
1.面粉中主要含有何种糖？
答：淀粉
2.糖含量定量测定的方法还有哪些？
答：①高效液相色谱法（HPLC）②苯酚-硫酸法③蒽酮法④双折射现象
幻想著。