生物素（biotin，B）, 又称维生素H 、B7,动 植物中广泛存在，卵黄 和肝中含量高；
MW244.31D,有两个环状 结构；
Ⅰ环为咪唑酮环，为与 亲和素结合部位；
Ⅱ环为噻吩环，含一个 戊酸侧链，其末端可与 生物大分子连接，形成 生物素标记物。
咪唑酮环 噻吩环
羧基
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活化生物素 噻吩环上戊酸侧链
第十三章
生物素－链霉亲 和素标记免疫技术
Biotin-Avidin Labelling Immunoassay Tech
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第一节 生物素和亲和素 第二节 生物素和亲和素标记物的制备 第三节 生物素和亲和素系统的技术方法 第四节 技术评价与应用领域
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T lymphocyte
第一节 生物素和亲和素
PAP-ABC复合法检测原理示意图
第四节 技术评价与应用领域
一、技术评价 1、生物素（B）和亲和素（A）之间的
高亲和力，使反应试剂经得起高度稀 释，降低或避免了非特异性结合； 2、二者均可偶联蛋白质、核酸、多糖 等活性物质； 3、具有多级放大作用，使其具有高灵 敏性；
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二、应用领域 1、BAS与免疫标记技术 适用于微量抗原、抗体及其他生物活性物质
可影响标记物活性，如碱性磷酸酶标记 后活性会降低；
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亲和素（avidin,A） 从蛋清中提取的一种碱性糖蛋白，耐热及多种
蛋白水解酶作用，每个分子由4条相同亚基组 成，每个亚基都可以结合一个生物素分子。 与生物素结合的特异性高、稳定性好。
K=1015L/mol（BA），K=105～11L/mol（antigen-antibody）
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二、亲和素标记物的制备 1、几乎所有用于标记的物质均可与亲
和素结合，小分子如I125、胶体金、荧 光素；大分子如蛋白酶、抗原/体、荧 光蛋白等 直接标记法：A+E 改良过碘酸钠法、戊二醛法
间接标记法：A+B+E
2、直接标记法（HRP-A/SA） a.改良过碘酸钠法
b.戊二醛法
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第三节 生物素和亲和素 系统的技术方法
特异性高、亲和力高、稳定性好、多级放大作用； 以BAS-酶免疫技术为例 一、桥联亲和素－生物素法（bridged avidin-
biotin technology,BAB法） 直接法：生物素标记在一抗上；
间接法：生物素标记在二抗上； T lymphocyte
2、与其他标记物（如酶、荧光素、胶体金）结合制成 新的标记物。
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3、生物素标记抗体（IgG）的制备 基本原理 生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）分子酯键中的-
C=O基团可与蛋白质分子中的氨基在碱性条件下形成肽 键，从而使其标记上生物素。
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4、实验流程
1、用二甲基甲酰胺（DMF）将BNHS配成1mg/ml溶 液；
的羧基经活化修饰 后形成的衍生物， 只有活化生物素才 能偶联各种其他生 物大分子，如蛋白 质、多糖、荧光素 等。
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生物素标记蛋白质的特点
生物素需活化后才能通过侧链与蛋白质 分子连接；
多价性-一个蛋白质分子可以被多个生物 素标记(放大效应)；
抗原、抗体标记后需保持活性不变； 多用BNHS标记抗体和中性或偏碱性的蛋 白质，BHZ标记偏酸性蛋白（抗原）
的定性和定量检测；
2、BAS与亲和层析技术 用于蛋白质纯化，为已 知配体寻找受体
基质颗粒-亲和素 （固 相）
生物素化抗体/配体（ 液相）
待分离物质（液相，含 目的抗原/配体）
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3、BAS与 亲和组织 化学技术
4、BAS与基因杂交 5、BAS与放射免疫显像 6、BAS与免疫-PCR
但与聚苯乙烯的非特异性吸附较高。
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亲和素活性单位 以亲和素结合生物素的
量来表示； 结合1μg生物素所需要
的亲合素量为1个亲合素 活性单位。一般1mg亲合 素约含13～15个活性单 位。
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链霉亲合素（streptavidin,SA） 与亲合素(A)有类似生物学特性的一种蛋白质。
由Streptomyces avidinii菌分泌的一种蛋白 质，SA分子量为65000，由4条序列相同的肽链 构成，每条SA肽链可以结合1个生物素分子。 SA与A的ka虽然相同，但在实际应用中其检测 灵敏度明显优于A。
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BAB法(直接法)检测原理示意图
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二、标记亲和素－生物素法（labelled avidin-biotin tech, LAB）
直接法
间接法
LAB法(直接法)检测原理示意图
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三、亲和素－生物素化酶复合物法（ABC）
ABC-双抗体夹心ELISA检测原理示意图
四、酶－抗酶－亲和素－生物素化酶 复合物法（PAP-ABC）
糖基化
多糖基化
无糖基化
结合生物素能力
4
4
亲和常数（K）
1015
1015
活性（U）
13～15
15～18
亲和素和链霉亲合素理化特性比较 9
第二节 生物素和亲和素 标记物的制备
一、生物素标记物的制备
1、作为标记物，活化生物素直接标记大分子生物活性 物质如抗原、抗体；
根据抗原或抗体分子所带可标记基团的类型（氨基、醛基或巯 基）以及分子的等电点
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A的高pI及高含糖结构导致在聚苯乙烯板和硝酸纤维素膜上或与组 织细胞DNA结合时，易产生一定程度的非特异性结合，造成较高的 显色背景，而SA较A在应用中明显克服了这一缺点。
亲和素（A）
链霉亲合素 (SA)
结构
四亚基
四亚基
分子量
68kD
65kDpI10来自6.0氨基酸特点
碱性氨基酸较多
酸性氨基酸较多
戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与 酶和亲和素上的氨基共价结合，形成酶-戊二 醛-免疫球蛋白结合物。
戊二醛分子式
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3、间接标记法（A/SA-B-HRP）
首先将HRP标记上生物素 再利用亲和素与生物素间的特异结合能力，合
成亲和素-生物素-HRP复合物（ABC）
注意事项：如何除去未标记物？ 各种成份的比例？
2、用0.1mg/L,pH9.0 NaHCO3溶液将纯化的1g抗体 稀释为1～2g/L;
3、按BNHS：抗体1：8 ～1：15（体积比）混合， 室温搅拌下反应2 ～4小时；
4、装入透析袋，用0.05mol/L、pH7.2 PBS，4 ℃ 透析过夜；
5、结合物内加等体积甘油，小量分装，-20℃冻 存备用。