7. 加含10%FBS的DMEM10ml，吸管轻匀吹打， 尽量使组织分散。
8. 离心1500rpn，5分钟。 9. 弃上清，加10mlDMEM10%FBS，吸管轻匀吹
打，200目滤网过滤，取少量滤液镜下细胞计数。 10. 以105的接种于培养瓶中，标记后置37℃，含
5%CO2培养箱培养。 11. 12-24小时后，换液观察。
血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶 原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白 先吸附于底物上，悬浮细胞再与底物附着。
进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基 团）
潜伏期
此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细 胞株潜伏期一般为6～24小时。
对数生长期：
细胞数随时间变化成倍增长，活 力最佳，最适合进行实验研生长细胞传代
离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液
后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2
一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）
此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接 吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3 贴壁生长细胞传代
采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
贴壁生长细胞传代方法
1. 吸光培养瓶中的培养液。 2. 用无钙镁离子的PBS清洗细胞3遍. 3 . 加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个
瓶底为准），静置1-2 min（显微镜下动态监测）。 4. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 5. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细
胞悬液。 6. 吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 7. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 8. 将后者放入培养箱中培养。
细胞冻存与复苏
细胞冻存和复苏
细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。 细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、
经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。
停止期（平台期）：
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再 分裂
机制：接触抑制、密度依赖性
原代神经细胞培养操作步骤
1. 超净台紫外灯照射消毒，至少30分钟，开恒温水浴箱至 37℃
2. 取出高糖DMEM、FBS、胰蛋白酶复温。 3. 取新生鼠1只，0.5%的碘伏消毒，断头，取整脑于含5ml
的DMEM液培养皿中，分离大脑皮质于含1ml DMEM液 的另一培养皿（培养皿均置于冰盒上)。 4. 弯头剪刀尽可能剪碎组织。 5. 向剪碎的组织中另加DMEM4ml，全部吸入离心管，加 5ml胰蛋白酶。 6. 置37℃水浴中15分钟。
扫描电镜法显示支原体 附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体
细胞传代培养
培养细胞的生长过程
单
细
个
胞
细
系
胞
的
的
生
生
长
长
过
过
程
程
细胞周期
间期
G1期（ DNA合成前期） S期（ DNA合成期 ） G2期（ DNA合成后期）
M期（有丝分裂期）
细
原代培 养期
为新鲜组织自体内取出并在体外培养生长 至第一次传代的时期
原代神经细胞培养
原代培养细胞的生命归宿
原代培养期 传代期 衰退期
培养细胞的生长方式及类型
贴附生长型细胞
必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分 为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其 稳定形态的细胞。见于各种实体瘤细胞
悬浮生长型细胞
不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。见于各 种造血系统肿瘤细胞
培养细胞生长的条件
细胞的营养需要（培养基，血清，添加因子等） 细胞的生存环境
温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3-
pH: 7.2-7.4 渗透压 无污染 无毒
无 毒：无毒是培养细胞的必需条件。凡与
细胞直接或间接接触的东西都必须 是无毒的。
细胞培养常用的培养瓶、 培养皿、6孔板、96孔板
贴附生长型细胞
悬浮生长型细胞
每代贴附生长细胞的生长过程
游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）
游离期：
细胞接种后在培养液中呈悬浮 状 态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞 体呈圆球形。
10分钟一4小时
贴壁期：
细胞附着于底物上，游离期 结束。 底物：胶原、玻 璃、塑料、其它细胞等
细胞计数
培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生 长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细 胞数表示。
血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：人工计数
计数原则：计上不计下，计左不计右。 细胞数（ml）＝4大格细胞总数/ 4×10000 注意：镜下由两个以上细胞组成的细胞团应按单个细胞计算
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总 细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离 细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有 损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏 的效果。
用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从 而可以区分死细胞与活细胞。
注意事项：
无菌操作原则
细菌
微生物的污染 霉菌
无污染
支原体等
不同细胞类型的交叉污染
细菌污染
能改变培养液的pH值，使培养液变混浊。 细菌生长迅速，能消耗营养液和产生毒素。 抑制细胞的生长，毒性大的细菌可很快导致 细胞崩解死亡。
细菌污染
霉菌污染
荧光染色法(33258)显示染色体，细胞周围亮点为支原体
Giemsa染色法，附于胞质上黑点为支原体
胞
系
的
传代期
生
原代培养的细胞生长一定时间之后，如贴附 型细胞即融合成片而逐渐铺满底物的表面， 此时应将原代细胞分开接种至2个或更多的 新的培养器皿中，即传代，此即成细胞系。
长
过
程
衰退期
一般有限细胞系在此期的细胞开始时虽仍 然存活，但增殖已很缓慢并逐渐完全停止，
进而细胞发生衰退死亡。
传代培养
当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则 需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个 容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器 中扩大培养，为传代培养。传代培养的累积次数 就是细胞的代数，一般细胞的代数为50代。