诱导型多能干细胞的研究进展学院：生命科学学院专业：动物学姓名：***学号：********摘要：诱导型多能干细胞(iPSc)具备胚胎干细胞的分化潜能,同时又回避了伦理问题,因此具有广泛且重要的临床应用价值。

与胚胎干细胞相比，iPS 细胞有操作简便和高稳定性等优点可以应用于，如创建人类疾病的遗传模型，培育转基因动物用于器官移植，改善动物生产性状和抗病性，以及生物制药等领域。

本论文综述了iPS 细胞的诱导方式、诱导相关的诱导方式、iPS 细胞诱导相关的影响因素、iPS 细胞的发育潜能、iPS 细胞的重编程机制以及其应用前景。

关键词：iPS 细胞、诱导方式、诱导方式、影响因素、发育潜能、重编程机制、诱导型多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS细胞)是通过在体细胞中转入几个特定的转录因子,实现体细胞核的重编程而获得的可不断自我更新且具有多向分化潜能的类胚胎干细胞样细胞。

2006年Takahashi 和Yamanaka[1]从与干细胞多能性维持相关的24个候选因子中筛选出4个转录因子组合Oct3/4、Sox2、c-Myc和KlF4,利用逆转录病毒转染小鼠胚胎成纤维细胞和鼠尾成纤维细胞,成功诱导出小鼠iPS细胞。

这一消息在生物学界引起了巨大轰动,国内外科学家们开始对iPS技术产生极大的兴趣。

正是因为iPS细胞与胚胎干细胞有相同的发育潜能,并且它的获得不需要摧毁早期胚胎,从而避免引发伦理道德争论,所以迄今研究iPS细胞的热潮仍在持续,并且未来有可能替代胚胎干细胞用于临床研究[2]。

1 iPS 细胞的诱导方式1.1 病毒载体诱导法病毒载体诱导法是iPS 细胞早期研究的主要应用方法，该方法简便易行，且效果显著，其主要原理是：将外源刺激因子克隆到病毒基因组中，再通过病毒对受体细胞的感染而将病毒基因组序列和外源刺激因子永久性整合到受体细胞基因组DNA 中，使外源刺激因子在一定阶段发挥作用，诱导受体细胞完成重编程过程[2]。

1.2质粒转化诱导法质粒转化诱导法的核心原理是：将含有与重编程相关的转录因子插入到质粒载体上，并采用一定方式导入到受体细胞中，质粒在细胞内发挥作用，可在一定阶段于受体细胞中表达这些外源转录刺激因子，从而完成重编程过程。

在此过程中，转录因子本身并不插入受体细胞基因组［3］-［4］。

1.3蛋白质直接诱导法蛋白质是一切生命活动的体现者和执行者，外源转录因子要在重编程过程中发挥作用，也需表达成蛋白质才可执行。

所以，最理想的无病毒、非整合型的重编程诱导方式就是直接通过蛋白质来进行。

理论上讲，在刺激重编程的外源转录因子蛋白上连接合适的穿膜肽，即可辅助转录因子蛋白进入受体细胞中，发挥自身效应，诱导细胞完成重编程过程［5］。

1.4mRNA 转化诱导法一般认为，外源mRNA 进入细胞后，如果开始表达蛋白，就会激发细胞的自身防御性反应，甚至导致细胞的程序性死亡。

所以，mRNA 转化诱导法一直未被考虑采纳为iPS 细胞的重编程技术手段。

Warren 等［6］研究表明，如果在体外对mRNA进行适当的修饰，就可以使受体细胞识别这些RNA分子为自体成分，不引发细胞的自身防御性反应和程序性死亡，而且，mRNA 可正常翻译蛋白质，发挥其生物学作用。

应用这种方法，人们将重编程的转录因子mRNA 导入到人成纤维细胞中，成功实践了由mRNA 转化诱导重编程的方法。

1.5microRNA 诱导法MicroRNA（miRNA）是一类内源性的小RNA 分子，其长度约20 ～ 25 个核苷酸，一般由某些单链RNA 前体经Dicer 酶加工后生成。

这类小分子在细胞内具有重要调节作用，每个miRNA 可有多个靶基因，也可是几个miRNA 共同调节一个基因。

因此，这种方法可考虑用于诱导成体细胞重编程为iPS 细胞。

Anokye-Danso 等［7］应用miRNA 调控技术（特别是miR-302 ／ 367 集群），首次在不使用转录因子的条件下，将人和鼠的成体细胞重编程为iPS 细胞，获得了较高的重编程效率（可提高到10％左右），而且所获得的iPS 细胞可成功向生殖细胞、卵子等方向分化。

这项研究使体细胞重编程技术发展到了一个新的研究阶段。

1.6卵母细胞介导法目前，体细胞胞核转移融合技术在再生医学领域已得到了广泛的应用，特别是在动物个体无性繁殖方面已经取得了较大的研究进展。

但是到目前为止，由于受诸多因素的限制，该项技术在人体细胞试验方面尚未成功［8］。

2 iPS细胞诱导相关的转录因子Oct4是胚胎发育多能性相关的转录因子,属于POU转录因子家族中的一员,由Pou5f1基因编码产生,它是全能性的标志,能够促使内细胞团形成、维持ES细胞未分化前状态并促进其增殖。

因此,Oct4在维持干细胞多能性和干细胞的分化命运中起到重要作用[9]。

Sox2是Sox家族成员之一,也是胚胎发育早期多能性的一个标志基因,在内细胞团、外胚层和生殖细胞中有表达。

Sox2与Oct4一样对于维持干细胞的多能性状态是不可或缺的[10]。

c-Myc是Myc癌基因家族的重要成员之一,具有增强细胞增殖的能力,并且促进肿瘤的发生。

由于c-Myc具有引起iPS细胞产生肿瘤的风险,在重编程过程中去除该基因,结果发现诱导iPS细胞的重编程进程减慢,iPS细胞的形成效率显著降低,并且推迟iPS细胞克隆的产生[11]。

KlF是属于Kruppel样因子的锌指蛋白,具有癌基因属性。

在ESC自我更新过程中KlF4起着积极的作用,又有实验表明,Klf4基因对于ES细胞的自我更新和未分化状态的维持并不是必需的,可以由其他的一些转录因子或小分子取代[12]。

此外,Nanog和Lin28也是重编程过程中用到的转录因子。

所以,实现重编程的4个转录因子中,Oct4一直被认为是重编程过程中不可缺少,在重编程起始过程中起到重要作用。

而Sox2往往作为Oct4的协作因子对ESCs中的下游靶基因进行调控,二者是维持胚胎干细胞特征所必须的转录因子。

而Klf4和c-Myc作为癌基因,在重编程过程中其可能的作用是使成熟细胞产生肿瘤样转变,赋予细胞无限增殖以及快速生长的能力,都可被同一蛋白家族的其它成员所替代,因此Klf4和c-Myc可能并非是重编程过程所必需的因子。

3 iPS细胞的影响因素3.1重编程因子的选择2006年日本科学家Takahashi等[1]首次获得iPS细胞的方法是选用24种与维持多功能性相关的基因, 经过层层筛选确定了诱导小鼠胎儿成纤维细胞生成iPS细胞所必须的4个基因, 即Oct 4 、Sox2、Klf4和c-Myc。

随后进行的实验证实这4个基因能够对小鼠的多种细胞起作用[13] , 同样也适用于称猴和人类细胞[14]这4个因子的其他家族基因也能够诱导iPS细胞的生成。

如Soxl和Sox3可替代Sox2 , 但是重编程效率会降低;Klf2可替换Klf4， L- Myc和N-Myc也可替换c-Myc[15]。

另有报道表明, 不同的因子组合(如Oct 4 、Sox2、 Nanog和 Lin2 8)足以重编程人的成纤维细胞[16]。

3.2重编程因子的运输最初小鼠和人iPS细胞的获得是通过逆转录病毒和慢病毒完成的[17]。

但这些病毒系统由于能够永久地整合到基因组中, 其所诱导形成的iPS细胞的安全性受到质疑。

因此为了能够获得更好地适于再生医学应用的iPS细胞,就需要研发不发生整合的载体.载体传递和瞬时转染两种方法最先在小鼠细胞重编程中得到了应用并取得了成功[18]。

由此推测,瞬时转染方法也能应用于人类iPS细胞的诱导. 其自我沉默的特点本应是一种优势, 然而整合到基因组的几大缺陷抑制了这些逆转录酶病毒的使用: 1) 其转染性限制了进行重编程细胞的类型[19]。

; 20在iPS细胞诱导过程中逐渐地发生了沉默,与没发生沉默的病毒方法相比转换效率极低[20]; 30通过逆转录病毒诱导形成的iP S细胞通常会表达病毒基因[21]。

从而限制了其使用范围 尽管己有由慢病毒诱导iPS细胞的相关报道[22],但其在连续基因表达中的分化机制仍不清楚[23]。

3.3重编程细胞类型的选择在人和小鼠上首次进行重编程时所选用的是成纤维细胞和小鼠细胞的核转移实验[24].和人与小鼠的细胞融合实验证实。

成熟的成纤维细胞能够对重编程起重要作用。

现在，成纤维细胞的诱导技术已越来越简便.除了成纤维细胞。

小鼠其他类型的细胞如胃细胞、肝脏细胞、胰脏细胞、淋巴细胞和神经干细胞。

还有人类的角蛋白细胞、脂肪干细胞等都被成功地进行了重编程。

在选择靶细胞时, 必须要考虑以下几点: 1) 要选用易被转染的细胞; 2)细胞的年龄和来源; 3) 细胞的繁殖能力.4 iPS细胞的发育潜能不同的选择标记对于鉴定iPS细胞的质量很重要，Yamanaka等[25]以Nanog代替Fbx15作为选择标记时，所获得的iPS细胞在基因表达和DNA甲基化模式方面更类似于ＥＳ细胞，并能获得生殖嵌合的小鼠，证明了iPS细胞的多能性。

而要证明iPS细胞的全能性，则需要通过四倍体胚胎互补试验得到完全由iPS 细胞发育而来的成体动物。

Kang等[26]将iPS细胞注入四倍体囊胚后，成功得到了完全由iPS细胞来源的小鼠。

Zhao 等[27]也获得了完全由ｉＰＳ细胞来源的小鼠，由此也证明了ｉＰＳ细胞的全能性。

5 iPS 细胞重编程机制具有适当匹配的转录因子的体细胞是生成iPS 细胞的一个潜在有用的起始点。

研究发现，外源的转录因子的表达约需10 d，而后细胞就进入自我维持的多能性状态。

在重编程完成前有一些特定的标志性的分子进行表达，如Thy1 表达的下调和SSEA21 的上调是在最早期，而内源性Oct24、Sox22 的表达是在重编程的后期才有。

重编程的末期则体现在端粒酶活性的提高和X 染色体的沉默。

由转录因子诱导的重编程是一个渐进的过程，具有一个确定的中间过渡期；其中，含有可以重编程成功的过渡细胞，确定这一中间细胞的特性对于研究整个重编程的机制具有十分重要的作用[28]。

而表观遗传学的改变在干细胞分化和重编程过程中具有重要的作用。

近期随着大规模测序技术的不断发展，使得在全基因组范围内对表观遗传学变化的研究成为可能。

近期报道利用基因组学分析方法对重编程的机制进行研究，其结果表明对分化相关的转录因子抑制不完全和DNA 的去甲基化不完全是导致重编程效率低的主要原因[29]。

6 iPS 细胞的应用前景体细胞被重编程为iPS 细胞时，关闭了体细胞特异性表达的基因，开启了使细胞具有全能分化性能的基因，而当iPS 细胞分化时则会发生相反的过程。

在重编程过程中细胞会对基因开启和关闭进行一次全面的重新调整，这其中还需要一些转录复合体和调控RNA 的参与。