• Ulmer等（1993） – 将重组甲型流感病毒核蛋白( nucleoprotein，NP)的 cDNA片断插入含有巨细胞病毒(CMV)启动子的质粒中 – 将该质粒直接注射入小鼠的四头肌内 – 结果：小鼠产生了特异的细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答 和高滴度的抗体。
1994年在日内瓦召开的专题会议上将这种疫苗定名为基因疫 苗。
➢注射方式（皮内、皮下、肌内等），也可以用基 因枪注射接种
➢非注射方式：口服、鼻内滴注、鼻腔喷雾接种等
DNA注射剂量以实验动物种类而异。对小鼠而 言，最适宜的注射剂量为50~100ug，对小牛 注射则需500ugDNA，太少基因表达很低，太 高则不呈剂量相关。
年龄越小，DNA疫苗产生的效果越好
DNA疫苗的特点
主要包括基因工程亚单位疫苗，基因工程载体疫苗，核酸疫 苗，基因缺失活疫苗，及蛋白工程疫苗等五种。
基因疫苗
即将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的质粒上， 然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达 抗 原蛋白，诱导机体产生免疫应答。抗原基因在一定时限内的持 续表达，不断刺激机体免疫系统，使之达到防病的目的。
Genic Guard
——基因疫苗
疫苗的发展
第一代疫苗
减毒和灭活疫苗
第二代疫苗
基因工程蛋白质或多肽疫苗
第三代疫苗
基因疫苗
”基因疫苗的发展
Wolff等：小鼠基因治疗试验(1990) • 对照动物
– 将带有报告基因的质粒DNA直接肌肉注射入 • 意外发现：
– 肌细胞内：检测到该外源基因的表达产物
• 1992年， Tang等 – 将表达人生长激素的基因质粒DNA，导入小鼠的 表皮细胞 – 小鼠血中：检测到特异性抗生长激素抗体 – 再次注入加强剂量质粒： • 免疫反应增强。
②DNA分子克隆比较容易，使得DNA疫苗能根据需要 随时进行更新；
DNA分子很稳定，可制成DNA疫苗冻干苗，使用时 在盐溶液中可恢复原有活性，因而便于运输和保存；
④质粒本身可作为佐剂，因此使用DNA疫苗不用加佐剂， 既降低成本又方便使用.
⑤比传统疫苗安全，虽然DNA疫苗具有与弱毒疫苗相当 的免疫原性，能激活细胞毒性T淋巴细胞而诱导细胞免 疫，但由于DNA序列编码的仅是单一的一段病毒基因， 基本没有毒性逆转的可能，因此不存在减毒疫苗毒力回 升的危险 .
⑥将多种质粒DNA简单混合，组成多价疫苗，使DNA 疫苗生产的灵活性大大增加。
DNA疫苗发展中存在的问题
➢目前，DNA疫苗尚未得到广泛的应用，除了因为它是 一种新事物，不大为人所了解之外，它本身的安全问题 则是人们对它 的最大顾虑。DNA疫苗存在的问题如下：
➢外源DNA进入机体后是否整合到宿主基因组，导致 癌基因激活或抑癌基因失活。
➢鸡传染性喉气管炎病毒（ILT) 将分别构建的含有 鸡传染性喉气管炎病毒王岗株gB、gC和gD基因的 重组真核表达质粒及空载体质粒分组注射雏鸡，攻 毒后观察免疫保护效果。结果表明，重组质粒诱导 了免疫应答，免疫保护率达到79%，该基因疫苗可 以作为预防ILV的1个补充。
DNA疫苗的优点：
①DNA接种载体（如质粒）的结构简单，提纯质粒DNA 的工艺简便，因而生产成本较低，且适于大批量生产；
抗原基因重组到表达载体上的重组质粒疫苗，经肌肉注射或黏 膜免疫等方法导入宿主体内，通过宿主细胞表达抗原蛋白，诱 导宿主细胞产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗 疾病的目的。
基因工程疫苗
基因疫苗
“基因工程疫苗”与“基因疫苗”
基因工程疫苗
也称遗传工程疫苗使用DNA重组生物技术，把天然的或人 工合成的遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中， 使之充分表达，利用表达的抗原产物，或重组体本身制成的疫 苗。
➢分泌到细胞外的抗原被带有相应抗体的B细胞捕捉，在T辅 助细胞分泌淋巴因子的刺激下转化为浆细胞，大量分泌抗体。
基因免疫的原理
DNA疫苗的构建
①目的基因的选择： 侧重于免疫原性，即所表达的目的蛋白刺激
机体免疫应答的能力。目的蛋白中是否具有受 MHC分子限制的T细胞抗原表位，是保证核酸免 疫有效的先决条件。核酸疫苗所选择的目的基因 应尽量避免有害基因成分，特别是病毒或肿瘤的 核酸免疫。
• 新型疫苗（1990-） – "第三次疫苗革命” – 美国纽约科学院：疫苗学的新纪元(1995）
• 又称为： – DNA疫苗(DNA vaccine) – 基因免疫(genetic immunization) – 核酸免疫(nucleic acid immunization)
概念
• 基因疫苗(genetic vaccine) 是指一类将
➢DNA疫苗长期在体内表达是否会诱导机体产生免疫 耐受，长远来说，导致机体免疫功能低下。 ➢DNA疫苗作为一种外来物质，是否会引起机体产生抗 DNA抗体。
➢DNA疫苗诱导的CTL反应是否会对 其他细胞产生杀伤作用。
DNA疫苗的发展前景
近年来，许多畜禽病毒性传染 病，已不能依靠传统疫苗如灭 活疫苗、弱毒疫苗等对其进行 防治，DNA疫苗的出现使得 这一状况得到改善。编码病毒、 细菌和寄生虫等不同种类抗原 基因的质粒DNA，能够引起 脊椎动物如哺乳类、鸟类和鱼 类等多个物种产生强烈而持久 的免疫反应。 DNA疫苗被称 为继灭活疫苗和弱毒疫苗、亚 单位疫苗之后的“第三代疫 苗”，具有广阔的发展前景。
（1）既能诱导细胞免疫反应，也能刺激产生体 液免疫反应
原因：表达产物 •一部分在降解后与MHCI类分子结合 •一部分也可分泌出去， 经抗原递呈细胞(APC)等 途径与MHC-II类分子结 合
（2）安全可靠
• 可根据需要设计、选择
DNA疫苗的抗原基因，靶
向性明确; • 质粒载体上的CpG基序具
有强烈的佐剂作用，故 DNA疫苗接种时一般不需 外加佐剂。
基因免疫的原理
➢质粒DNA导入细胞后，抗原编码基因表达抗原蛋白，随后 被降解为8~12个氨基酸短肽。
➢短肽上含有抗原表位，分别与MHC-1类和MHC-2类分子结 合并被呈递到细胞表面 ➢与MHC-Ⅰ类分子结合的短肽激活CD8+T细胞( Tc ),与 MHC-Ⅱ类结合的短肽激活CD4+T细胞（ Th ）。
Байду номын сангаас
②载体的选择： 构建DNA疫苗的质粒通常是非复制型的真核 表达质粒，能高水平地表达目的基因。
重组质粒可分为两个部分： ● 转录部分：由启动子、插入的目的抗原 cDNA和poly A终止子组成，指导目的蛋白 在体内表达，诱发特异性免疫应答。 ● 佐剂部分：CpG基序。
③启动子的选择： 质粒在宿主细胞内 表达外源性蛋白的 水平与调控DNA表 达的启动子关系密 切。表达水平的不 同又直接影响免疫 应答的强度和持续
（3）价格低廉 • 质粒经转化细菌扩增后，
其提取、纯化等制备过 程远比蛋白质纯化技术 简单得多，省钱、省时 和省力，适宜于规模性 生产；
• DNA疫苗在常温下性能 稳定，可以室温保存， 不需要冷链运输，容易 保证高效接种率。
（4）多途径免疫接种， 易为免疫对象所接受，也有利 于模拟自然感染途径。 – 注射方式（皮内、皮下、肌 内等），也可以用基因枪注 射接种 – 非注射方式：口服、鼻内滴 注、鼻腔喷雾接种等
基因枪
利用高压气体加速， 将包裹了DNA的球状金粉或者钨粉颗粒 直接送入完整的植物组织或者细胞中 这一加速设备称为基因枪
DNA疫苗的应用
➢牛病毒性腹泻病毒（BVDV) 以表达BVDV1型主要糖蛋白 E2的质粒DNA肌肉注射小牛，可产生病毒中和抗体和抗原特 异的细胞增殖反应；免疫后16周进行攻毒试验，发现免疫牛 能产生针对BVDV1型和2型的血清中和抗体强烈的记忆抗体 反应，对牛有部分免疫保护作用
性。
④DNA疫苗的优化 ● 联合构建：在载体质粒中插入2个或2个 以上目的抗原基因，既能激活CD8＋T细胞产 生特异性CTL，又能激活CD4＋Th2细胞产生 体液免疫。 ● 协同构建：将目的基因与某种细胞因子的 基因构建成嵌合基因，以促进目的基因的免 疫效果。
⑤免疫途径、剂量、时间： 常见免疫途径有：