利用动物乳腺生物反应器生产人凝血因子LX 班级：生工《2》姓名：周誉学号：0802012040
【摘要】：
转墓因动物乳腺生物反应器是利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达并从转基因动物奶中获取重组蛋白利用转基因动物乳腺生物反应器生产人凝血因子LX是一种新型的生物制药方法且具有广阔的应用前景本文就转基因动物乳腺生物反应器生产人凝血因子LX的载体构建研究现状以及存在的问题等作一综述。

【关键词】：乳腺生物反应器凝血因子lx 、血友病氏转基因动物
【正文】
人凝血因子,人体凝血系统中重要的凝血因子它的缺乏会导致一种性连锁遗传的出血性疾病—血友病。

目前主要靠替代疗法。

即注射正常人血浆制剂以补充患者所缺乏的hfix。

然而这种治疗存在着血液来源困难以及有从供血者传染肝炎病毒，爱滋病病毒等致病因子的危险。

因此，传统的从血浆中提取hfix的方法远远不能满足临床需要。

虽然通过重组DNA技术已能够在鼠肝细胞株中合成有生物活性的hfix。

但是产量低，成本昂贵也难以满足实际需要。

而转基因动物乳腺生物反应器是基因制药的新方法。

通过转基因动物建立哺乳动物乳腺生物反应器来生产珍贵的药用蛋白也是近年来生物工程领域的研究热点。

1.乳腺生物反应器生产人凝血因子lx
乳腺生物反应器是基于转基因技术平台使外源基因导人动物基因组中并定位表达于动物乳腺并能从动物乳汁中获取具有重要价值的重组蛋白的转基因动物的总称。

由于哺乳动物的乳房是一种天然的高效合成蛋白质的器官当外源基因的产物定向表达于乳腺时，可直接分泌于乳汁中而不损伤转基因动物本身特别是羊牛的泌乳量大，活性蛋白的产量高又容易收集。

因此转基因动物乳腺生物反应器就像一座生产活性蛋白的药物工厂只要牛羊吃的草就可以从奶中源源不断地生产出人类所需的药用蛋白质来.
根据临床实际需要来看,血友病性B传统治疗方法和基因治疗方法都不能满足实际临床需要。

利用哺乳动物细胞培养法和微生物发酵法生产LX成本极高,浓度低,纯化困难且生物活性低而乳腺生物反应器技术完全弥补了它们的不足.其优越性主要体现在乳汁分泌表达的药用蛋白经过哺乳动物体内复杂的加工和修饰其生化特性生物学活性和功能与天然蛋白完全相同.哺乳动物乳汁中的蛋白质种类较少主要是酪蛋白乳球蛋白乳清蛋白等因此提纯重组基因在乳汁中生产的目的蛋
白比较容易不需要复杂的工厂设备以哺乳动物的乳腺生物反映器生产药用蛋白是一个农业过程可以充分利用可再生的天然资源不会对环境造成不良影响动物乳房生产外源蛋白产量很高这会大大降低一些稀有药用蛋白的生产成本
根据有关专家分析利用转基因动物乳腺生物反应器生产有着非常广阔的前景
人凝血因子Ⅸ蛋白(hFIX)是治疗血友病B(Hemophilia B)的有效药物，临床治疗血友病B 所用人凝血因子Ⅸ来源于人血浆，不但成本高而且容易受到肝炎病毒和爱滋病毒的污染。

近年来，人们设想通过转基因动物乳腺组织即乳腺生物反应器生产hFIX蛋白，以开辟更广阔更安全的药物来源。

因此开展人凝血因子Ⅸ乳腺生物反应器的研究具有重要的经济意义和临床应用价值。

为了建立人凝血因子IX乳腺生物反应器，首先探索了通过病毒途径直接转染乳腺组织建立乳腺生物反应器的可行性，以MCK增强子，β-actin启动子控制hFIX小基因(minigene)表达顺序反向插人G1Na框架，构建复制缺陷反转录病毒载体并制备重组反转录病毒颗粒；以CMV启动子，hFIX cDNA和腺病毒框架构建腺病毒载体pAdCMVhFIX，与质粒pJM17共转染包装细胞制备含hFLX基因的重组腺病毒颗粒。

病毒颗粒通过直接转染活体奶山羊乳腺小叶和输人管导人两种方式建立了hFIX蛋白的乳腺表达系统和快速检测系统。

重组反转录病毒转染后，hFIX蛋白在奶山羊乳汁中的分泌表达量最高达47.9ng／m1，持续时间在2个周以上。

乳汁中hFIX蛋白80％以上具有生物学活性。

与输人管导人的方式相比，直接转染奶山羊乳腺小叶的方式转染乳腺组织，目的基因转染靶细胞的效率及其在乳汁中分泌表达的水平较高。

其次，构建了β-Casein基因，β-lactoglobulin基因控制的hFIX基因、LacZ基因乳腺组织特异性表达载体。

将hFIX基因乳腺表达载体转入了人乳腺腺癌细胞株(MCF-7细胞)，中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，人胚肾上皮细胞(293细胞)，兔皮肤成纤维细胞(RSF细胞)中，研究了这些载体在离体细胞中的表达情况，发现MCF-7细胞较CHO细胞、293细胞、RSF 细胞更适合于作为乳腺特异性表达载体的离体表达系统，但与活体水平相比尚有缺陷。

以Stearylamine(SA)阳离子脂质体介导，尾静脉注射的方法将乳腺特异性表达载体导人哺乳期雌性小鼠的体内建立IX因子表达的快速检测系统；对一系列乳腺特异性表达载体构建的有效性，目的基因在乳汁中的表达水平作出评估；研究了β-casein基因的5’区，β-casein基因和hFIX基因各自的内含于1对hFIX基因在乳腺组织中表达调控的作用。

发现：β-casein基因5’端2．0kb的调控顺序可以指导hFLX基因在乳腺组织中的分泌表达；β-casein基因的intronl能够影响目的基因表达的乳腺组织特异性，可能其中含有乳腺特异性表达的顺序；hFIX基因自身的intronl能够明显提高hFIX基因在活体乳腺组织中的表达水平，和hFLX cDNA相比，hPⅨ基因自身的内含子1能够提高该基因在活体乳腺组织中的表达水平3倍以上；β-Lactoglobulin基因5’端873bp的调控顺序可以指导hFIX基因在乳腺组织中表达。

另外，将表达载体直接转入奶山羊的乳腺组织，研究了hFIX基因在奶山羊乳汁中分泌表达的可行性。

将通过以上研究筛选得到的pMCIXm表达载体采用显微注射技术注入小鼠和奶山羊受精卵细胞，获得6只外源基因稳定整合的转基因小鼠和5只转基因奶山羊．其中在2只转基因小鼠和1头奶山羊乳汁中测得hFIX蛋白的表达，表达水平在100ng/ml以上。

一期法证实，转基因小鼠和奶山羊乳汁中的hFIX蛋白具有凝血活性。

2 .建立乳腺生物反应器的基本方法。

建立hfix乳腺生物反应器的基本方法。

第一：载体构建，使基因的表达仅限于乳腺织，而且能够实现外源蛋白的全活性高水平分泌表达。

第二：用显微注射射技术将构建好的载体直接注射入山羊受精卵的原核中并将注射的受精卵移入假孕母羊输卵管内继续发育。

第三妊娠后出生的幼怠为转基因羊在它们的泌乳期选择乳汁中表达有hfix的母羊. 第四表达量最高的母羊产下的第二代公羊作为第三代转基因羊然后根据市场需要大量繁殖转基因羊。

3. 展望
据了解我国血友病发病率为1/100 000，故利用乳腺生物反应器生产人凝血因子LX在我国具有广阔开发前景和快速的经济效益。

目前人们利用转基因动物乳腺生物反应器生产hfix已取得了可喜的成绩。

但，首先，人们还应该在表达载体的构建方法上进一步改进更有利于大规模生产hfix。

其次还应该解决转基因动物的低效率，目的基因的低水平表达及随机整合等问题。

再者，还应该在产品的纯化技术上有所突破。

目前国内外均无成熟的纯化技术但是双水相体系用于分离纯化hfix纯度高达95%以上。

有望成为分离纯化转基因药物的新技术。

总之，随着新科技的不断开发与应用。

乳腺生物反应器必将成为一种简便大量低成本的生产药用蛋白的方法。

最终形成一种全新的生物医药产业这也将推动我国的转基因药物在!世纪的生物医药产业革命中占有一席之地。

【参考文献】
1.曾溢滔转基因动物与生物医药产业【J】. 生物学通报,1999,34(4):1-3
2.张克忠，崇松，陈立等人凝血因子LX乳腺特异性表达载体在离体细胞和
活体细胞中表达的初步研究【J】.复旦学报，1998,4
3.黄淑帧张克忠黄英等乳汁中分泌有活性的人凝血因子LX转基因羊的研制
【J】.科学通报，1998，（43）:783-784 ,。