肿瘤干细胞培养技术随着干细胞生物学以及肿瘤学研究得不断深入,肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究得热点、肿瘤干细胞得体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代得重要地位,通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤得演化、转移与抗药性等进行研究,为肿瘤得早期诊断与治疗提供了新得思路与策略。

肿瘤干细胞得体外培养多采用无血清培养基(serｕｍｆree meｄium, SF Ｍ),根据不同得细胞类型加入适当得细胞因子联合培养以防止其分化。

肿瘤细胞系或者就是临床肿瘤组织联合采用机械与胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液,经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选得方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在饱与湿度得条件下进行体外培养,但值得注意得就是临床肿瘤组３7℃,５％CO２织得获取应该越新鲜越好,最好就是在外科手术后１小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞得活性,不利于体外培养。

无血清培养基有很多种,针对不同得细胞类型有专门得无血清营养液出售。

无血清培养基具有以下得优点:各批产品之间成分相对明确、质量相对一致;便于控制培养得生理环境;特殊细胞类型得优化配方有利于提高细胞得稳定性,使不同类型得细胞能在最有利于各自生长得环境中持续传代培养;依据不同类型得细胞、甚至不同得细胞系(株)都可能有各自得无血清培养基。

总得来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分［1］。

基础培养基一般采用人工合成得培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraＣULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEＭ/F１2(1:1,Iｎｖitｒoｇen)最为常用。

附加成分就是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需得营养成分,包括①营养因子:胰岛素、转铁蛋白与亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、Ｌ—谷氨酰胺;②细胞因子:白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。

使用无血清培养基培养得细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶得作用,可使用０.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(sｏｙbeaｎ trypsin inhi ｂiｔｏr)。

一、肿瘤干细胞培养中几种常见得细胞因子(一)白血病抑制因子ＬIF(leukｅmｉn ｉnhibitｏｒｙ faｃtｏr,LIF) 就是白介素６(ＩL-6)细胞因子家族中得一员,就是典型得多功能生长因子,具有多种生物学功能:对细胞生长、增殖与分化有着广泛得作用,抑制分化促进干细胞增殖。

胚胎干细胞得体外培养需要添加LIＦ以抑制其分化,维持其多能性。

LＩF 可抑制成纤维细胞生长因子(Fｉｂrｏbｌast Growth Faｃtor ,ＦGF)、β转移生长因子(β—transforminｇ Gｒowｔh Ｆactoｒ,TＧFβ)与叶酸(Rｅtin ｏｉc Aｃid ,RＡ)诱导得细胞分化。

(二)干细胞因子(ｓtem cell ｆactｏr,SCＦ) 又称肥大细胞生长因子(MGF),Kit配体(KL)及Steel因子(SＬF),SCF可以诱导干与祖细胞增生。

ＳCF 主要由脑、肝脏、骨髓、胎盘等组织(尤其骨髓)中得基质细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肝细胞产生。

SCF就是一种作用于最早期造血干祖细胞得造血细胞因子,在维持造血及肥大细胞存活、促进造血细胞增殖与分化、调控各系造血细胞得生长发育过程中起着重要作用。

(三)表皮生长因子(epiｄermal growth faｃtｏｒ,ＥGＦ) 就是含有53个氨基酸得多肽, 早期研究中发现其有剌激表皮细胞生长得作用,就是表皮细胞培养得最常用得添加因子之一、EGＦ可显著促使细胞分裂、增殖,在一定浓度范围内(5~20nｇ/ｍl),随EGＦ浓度提高,效应加强。

(四)碱性成纤维细胞生长因子(ｂasic ｆibｒobｌａst grｏｗth fａcｔor,bＦGＦ) 1９７5年Gｏｓpodarowicｚ及其同事从牛大脑与垂体中分离纯化出一种分子量为1６—18kD由146个氨基酸组成得阳离子多肽,并将其命名为成纤维细胞生长因子、bＦGF具有多种生物学功能,可以促进与调节血管内皮细胞、上皮细胞、与神经胶质细胞等多种起源于中胚层、神经外胚层源性得许多种细胞得增殖与分化。

二、肿瘤干细胞目前肿瘤干细胞已经在多种肿瘤细胞系以及白血病、脑瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等多种肿瘤组织中分离鉴定与培养。

不同组织来源得肿瘤特性不同得,培养条件也不完全相同,本章就已有报道得从不同肿瘤细胞系或者肿瘤组织分离得肿瘤干细胞得体外培养体系加以阐述,在实际操作中读者需要经过摸索才能针对不同得肿瘤干细胞建立稳定得体外培养条件。

(一)白血病干细胞 ALL急性淋巴细胞白血病干细胞(CD３４＋/CD10–／ＣＤ１９–)采用悬浮培养体系培养[２]。

ＡLL急性淋巴细胞白血病患者来源得骨髓用Ficoll分离得到单个核细胞(MNＣ),使用IＭDＭ(Gibco)添加５0% FCS(Gibcｏ)与10％ DＭSO二甲基亚砜(Manｏr PａrｋPｈarmaceuticａｌs)冻存液将分离得到得MＮC在液氮中备用。

培养时以5×1０5个/ｍL密度接种在IMＤM无血清培养基中,添加了10μg/mＬ人胰岛素,２00μg／ｍL转铁蛋白( Ｓigｍa—Al ｄrｉch)与2％ HAS。

使用时以下两组生长因子任选其一:①20ng/ｍL重组人Fm ｓ样酪氨酸激酶3 (rhFlｔ3) 配体、20ng/mL 重组人白介素3 (ｒｈIL—３)、20ng／ｍL rｈIＬ-6、2０ng/mＬrhＧM—CSF、20nｇ/ｍL rhＧ-CSF与5０ng/mL SCF。

②20nｇ／mＬrhＩL－3、1０ｎg/ｍL ｒhIL—7与５０nｇ/ｍＬＳCF (R ＆D Ｓystｅms)、每周半量换液一次,培养6周后收集细胞用于细胞遗传学与形态学分析。

(二)乳腺癌干细胞乳腺癌干细胞培养多参考Mａx Wicha及其同事建立得人乳腺上皮干/祖细胞体外悬浮培养体系［3］,在无血清培养基中乳腺上皮干细胞呈悬浮非分化形式生长,我们称之为乳腺干细胞球。

原代培养时在超低粘附板(Corning)以2０000个/mL活性细胞传代时以1000个/mL密度进行培养。

无血清培养基选择无血清乳腺上皮生长培养基ＭEGM(BiｏWhittaｋer),添加了B27 (Invitrogen)、20ng/mｌ EGＦ、2０nｇ/mLbFGF(BD Bｉoｓcienｃｅs)与4μｇ/mL肝磷脂(Sｉgma),不添加牛垂体浸膏、乳腺干细胞球培养7－10天后用0.05％胰酶与0．53ｍM ＥDTA-4Ｎa消化10分钟(Invitrｏｇｅｎ),收集细胞到离心管中８00rpm离心。

离心后得到得细胞需通过40μm滤膜并且在显微镜下观察就是否为单个细胞。

10000个单细胞悬液中两个相连、三个相连、多个细胞相连得团块数量应该在30到15０之间,如果细胞团大于〉１0０需要重复进行消化与过滤得步骤。

外科手术得到乳腺癌实体瘤中乳腺癌干细胞(CD4４+ / ＣD24− /ｌoｗ)得培养需要在手术后30分钟内对乳腺癌标本进行处理,在胶原酶(Rｏcｈe)与透明质酸(Sigmａ)按1:1比例配成得消化液中37℃消化2小时后通过３0μm滤膜后得到单细胞悬液。

以100０个/mL无血清DMEM－F１２ (Cambrｅｘ), 添加10ng/mL bF ＧF、 2０ng/mL EGF、5μg/m L胰岛素与0.4％牛血清白蛋白(Sｉgma)。

细胞在上述培养基中呈悬浮球状细胞团生长,每隔3天使用胰酶－ＥDＴA消化2分钟后传代［４］。

乳腺癌细胞系ＭCF-7与MＤA—MＢ-231中分离得到乳腺癌干细胞(CＤ24−／l ｏｗ／ＣD44+),收集细胞５00g离心5分钟,使用Ｈanｋs’缓冲盐溶液洗涤后以１０00个/mL重悬于无酚磺酞得ＤMEM –Ｆ12 (Cellｇrｏ) 添加0、4%牛血清白蛋白BSＡ(Sigma)、５μg/ｍＬ牛胰岛素(Sigｍa)、20ｎg/mL bFGF ( Sigmａ)与1０ng／mL ＥGF (Ｓｉgma) ,每三天换液一次［５］。

(三)脑胶质瘤临床获得得肿瘤标本使用lympｈolｙte－M (Cedarlanｅ)去除红细胞,在充氧得人工脑脊液中使用胰酶消化成单细胞悬液,总得来说,每份肿瘤标本大概可以获得2－5×106个细胞。

肿瘤细胞使用TSM(tumｏr spｈere medｉum)肿瘤细胞球培养基,添加20 ng/mｌ重组人ＥGＦ (Ｓigma)、20nｇ／ｍl ｂFＧF (Upｓtate)、10ng/mｌ LＩF(Ｃhemiｃon)、１×神经元存活因子NＳＦ(Ｃlonetiｃs)与60μg／ml Ｎ－乙酰半胱氨酸(Ｓｉgma), 使用60－ｍm细胞培养板进行培养确保活细胞数量为３×106。

原代培养三天后免疫磁珠分选得到CＤ133+脑胶质瘤干细胞,使用上述细胞培养基培养［6］。

也有学者从临床肿瘤组织获得得单个肿瘤细胞悬液在Neuroｂaｓal培养基(Invitｒogen),添加2mM L—谷氨酰胺、N2 (Invitrogen)、Ｂ27 (Ｉnvitrogen)、20ng/ml ｈrEGF (Ｉnviｔrogeｎ)、2０ng／ml hrbFGＦ (Ｉnvｉtrogen)与5０mｇ/mｌＢSA。

实验中使用得细胞应该在4代之内,分选得到得Nestiｎ＋／CD13３＋细胞即为脑肿瘤干细胞[7］。

大鼠胶质瘤细胞系C6采用SP分选得方法得到脑胶质瘤干细胞［8］, 在１００—mｍ培养盘中(Nunc)使用无血清得ＤMEM培养,添加了１0μg/mｌ牛胰岛素、1０0μg/ml人转铁蛋白、1０0μg/ｍl BSA、60ｎg/ml黄体激素、16μg/ml四甲烯二胺、4０ng／mｌ亚硒酸钠、63μg/ｍl N－乙酰半胱氨酸、5μM血小板凝集抑制剂forskoliｎ、50units／ml青霉素、50μg/ml链霉素(GIBＣO)、1０ng ／ｍｌbFGＦ与10ng/ml PDGF、大鼠胶质瘤细胞系9L,无血清NＳC增殖培养基采用DMEＭ/F1２添加20ng/m ｌEGF(Peproｔech)与bFGF(Pｅpｒoｔeｃh)、50ｎｇ／ml肝磷脂、１×B27 (Ｇibcｏ)。

每隔两天换液一次。

当肿瘤细胞球达到100–200个时使用0、1%胰酶与1×EDTA (Gibco) ３７°C消化1０分钟。

通过2５μm细胞滤膜(BD Bｉosｃｉｅnｃes) 以100０个／mｌ密度接种在添加促有丝分裂剂得NSC培养基中每隔两天换液一次,1８天后可以进行细胞得传代,培养得细胞球即为具有化疗抵抗与侵袭能力得肿瘤干细胞样细胞［9］。