钠溶液(2．8 mol/L、3．2 mol/L 、3．6mol/L )；将水悬液加入溴 化钠溶液中，离心分离出黑色的杂质；弯头注射针沿壁插入，收 集晶体的溴化钠溶液；重复上述步骤；得到的溶液于4℃ 7000 r·min 离心，收集晶体沉淀并用蒸馏水洗涤2～3次，配成晶体水 溶液；置于冰箱中冷冻过夜后，放人冷却干燥机中24 h除去冰溶 液中的水，即得到白色的伴孢晶体。
抗生素选择性筛选
B.t.较其他芽孢杆菌对抗生素的抗性显著。用 抗生素处理后可以有效分离出B.t.，但由于B.t. 各亚种之间对抗生素的敏感性不同，个别亚种 会因抗生素浓度过高而不能形成芽孢和伴孢晶 体，从而造成漏筛。将醋酸钠和抗生素分离法 合二为一，可大大提高分离效率。
从植物中分离B.t. 从植物中分离
苏云金芽孢杆菌毒素的生产工艺
苏云金芽孢杆菌
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，B.t.） 于1901年由日本科学家S.Ishwata从家蚕中发 现至今已有109年历史。 B.t.已成为目前产量最大、应用最广的一类微 生物杀虫剂，占到生物农药生产量和使用量的 90%左右。
B.t.杀虫毒素主要有三种
液体双相分离法： 液体双相分离法：利用互不相溶的两种液体对晶体
和芽孢的亲和性不同(即晶体、芽孢表面特性不同)而达 到分离目的。
等电点沉淀法： 等电点沉淀法 若在某一pH 值下氨基酸净电荷为零，
且在电场中不移动时，此pH 值为它的PI值(等电点)。 大部分蛋白质于等电点的pH值下，其溶解度是最小的
离子交换分离法： 离子交换分离法：利用离子交换树脂上的可交换离
利用醋酸钠进行选择筛选
B.t.芽孢的萌发直接受pH值影响。加入适量醋 酸钠的培养基可以选择性地抑制B.t.芽孢的萌 发，经热处理而不被杀死；而其他种类芽孢杆 菌因其芽孢萌发，经热处理后被杀死。利用这 种筛选分离方法可以消除干扰菌以达到高效分 离筛选的目的。
弹土分离法
将土壤样品干燥后研碎，洒在灭菌滤纸上，待 滤纸面上沾有一层均匀样品粉末后对着培养皿 口轻弹，后培养。该方法简单，但培养后检出 的菌类数量大，种类多，不易识别纯化。
子发生的变换反应达到分离和提纯的目的。常借助离 子交换柱进行动态离子交换以实现这一目的。酶和蛋 白质都有电解质性质，故可用离子交换法进行分离提 纯。
碱裂解法： 碱裂解法：苏云金芽孢杆菌产生的伴孢晶体是一种
碱溶性蛋白，由cry基因和cyt基因所编码。在pH值高 于9。5时，大多数的cry毒素和cyt毒素溶解，少数需要 在pH值为12时才完全溶解。因此选用pH值9。6的碳 酸钠缓冲溶液才能保证大多数的蛋白质从菌体中溶出。
分离、发酵、 分离、发酵、纯化技术
B.t.分离技术主要有以下几种： 分离技术主要有以下几种： 分离技术主要有以下几种 土壤分离技术 ：温度筛选、 利用醋酸钠进行 选择筛选 、弹土分离法、 抗生素选择性筛选 从植物中分.t.的芽孢因为中皮层主要成分为肽聚糖和形 成过程中产生大量DPA-Ca螯合物而具有耐热 性，在80℃下热处理20min也不会死亡，在 75℃的亚致死温度下处理15min可以提高其成 活率。利用这一特性，可以进行温度筛选。温 度筛选范围广，不易漏筛，但是工作量大且B.t. 要达到一定浓度。
ICPs纯品的制备 纯品的制备
ICPs纯品的制备： 目前纯品的制备方法主 纯品的制备： 纯品的制备
要有等密度梯度离心法、液体双向分离法、等 电点沉淀法、离子交换分离法、碱裂解法、高 速离心法、生物物理法等。
等密度梯度离心法
等密度梯度离心法是利用密度的差异将伴孢晶体与杂 质分离，从而获得纯品。 其常用的密度试剂有蔗糖 、人工聚合蔗糖、碱金属盐 (CsC1、NaBr)、碘化密度梯度介质等 溴化钠密度梯度离心纯化实验步骤： 溴化钠密度梯度离心纯化实验步骤：配制密度不同的溴化
2、苏云金素即 外毒素。是部分B.t.分泌到体外的一类核苷 苏云金素即β-外毒素 苏云金素即 外毒素。
类物质，具有热稳定性和广谱杀虫作用，对蝇类幼虫、夜蛾科和 鞘翅目害虫有很好的杀毒作用。
3、芽孢。当受感染昆虫中肠受伴孢晶体损伤后，活芽孢萌发成 芽孢。 芽孢
营养体，穿透肠壁进入血液并大量繁殖，使昆虫患败血症死亡。
1、伴孢晶体（ICPs）即σ-内毒素。 蛋白质，在昆虫体外 伴孢晶体（ 内毒素。 伴孢晶体 ） 内毒素
与特定的生物膜类脂物相互作用使其重新排列，最终导致细胞溶 解。在活体内，因昆虫肠液碱性条件和酶的作用降解成毒性多肽， 使昆虫肠上皮细胞的酶功能、蛋白质代谢和运输过程受干扰，或 是作为酶的抑制剂和细胞自溶的启动剂造成内质网空泡，线粒体 瓦解，最终细胞自溶使昆虫死亡。
生产上的应用
B.t.菌生物农药制剂防治农业害虫 菌生物农药制剂防治农业害虫 将B.t.的ICPs基因转入其他物种获得抗虫植物 的 基因转入其他物种获得抗虫植物
有研究表明，B.t.普遍存在于植物叶面，叶面 菌群有高度的血清型特异性，植物物种和B.t. 菌株表型不存在相关关系。采用植物微生物分 离常用方法，再结合4%NaCl培养基选择分离 法、土壤B.t.分离法中的醋酸钠分离法和抗生 素分离法等就能分离得到较纯的B.t.。
发酵技术
B.t.的工业生产主要分为菌种培养、发酵、浓缩（离心 或板框过滤）、干燥、剂型化、产品检验六道程序。 目前，B.t.的大规模生产主要采用液体深层发酵。 B.t.的最佳培养条件为：在恒温培养箱中，使用液体发 在恒温培养箱中， 在恒温培养箱中 酵培养基(胰蛋白胨 胰蛋白胨1． ％，葡萄糖0． ％， ％，葡萄糖 ％，玉米粉 酵培养基 胰蛋白胨 ．0％，葡萄糖 ．5％，玉米粉 0．5％，酵母膏 ．2％，磷酸氧二钠 ．1％ ，磷酸二 ％，酵母膏 ％，磷酸氧二钠 ． ％，酵母膏0． ％，磷酸氧二钠0． ％ 氧钾0． ％ ， 培养瓶中配制25mL培养液， 培养液， 氧钾 ．1％)，l50ml培养瓶中配制 培养瓶中配制 培养液 30℃培养 ℃培养36h，振荡频率为 ，振荡频率为250次／min。 次 。
杀虫晶体蛋白（ 杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）的纯化 ， ）
ICPs粗品的制备： ICPs随着B.t.孢子囊的破裂而释 粗品的制备： 粗品的制备
放。用磁力搅拌器搅拌分离培养纯化后的B.t.制成的菌 悬液，除去泡沫层中较轻的孢子，重复几次基本除尽 孢子后，用超声波处理使ICPs和芽孢均匀分布，离心 弃上清液，用特殊试剂处理以消除晶体蛋白酶对晶体 的非特异性降解作用后，溶于生理盐水即制成粗品。 粗品中残留细胞碎片、不溶性培养基和芽孢，需进一 步纯化。
固态发酵
固态发酵是B.t.生物农药生产的一种新方式。相较于液 体发酵，具有培养基对环境污染少、易处理，能源消 耗量低，技术设备简易，产物浓度高，后处理方便等 优点。作为一项新型技术，固态发酵还存在着很大的 发展空间。 无论是液体发酵还是固态发酵，都需注意培养基中营 养物质、pH、温度、含氧量的控制。对于B.t.的发酵 生产，还需注意噬菌体的长期污染会降低产量。