一氧化氮电化学传感器及其在生物医学中的应用陈晓霞１，３ 易洪潮２ 王 颖１ 胡胜水１，３＊（１武汉大学化学与分子科学学院 武 汉 ４３００７２）（２长江大学化学与环境工程学院 荆 州 ４３４０２３）（３中国科学院传感技术联合国家重点实验室 北 京 １０００８０）摘 要 一氧化氮（ＮＯ）是一种含有可以调控不断生长的生物学过程的非共享电子对的气体自由基，它由一氧化氮合成酶家族的Ｌ－精氨酸所形成。
ＮＯ在人体内分布广泛，是帮助机体抵抗心血管疾病与其他疾病的信号分子。
缺乏ＮＯ可能导致糖尿病、心血管疾病与其他疾病，而补充ＮＯ可预防和逆转此类疾病。
ＮＯ是非常小的分子，十分活泼，半衰期短，它可以进入细胞，并向周围的细胞发出交流信号。
但是，要准确检测其在生物体中的含量很困难。
目前直接用于一氧化氮检测的方法不多，电化学方法尤其是电化学传感器是应用广泛的一类方法，由于其操作简单，灵敏度高，选择性好，已成为现代生物医学中研究一氧化氮的重要工具。
本文主要综述近年来ＮＯ电化学传感器的研制及其在生物医学中的应用。
关键词 一氧化氮；电化学传感器；生物医学中图分类号 Ｏ６５７．１Electrochemical Nitric Oxide Sensors and Its Application in BiomedicineChen Xiaoxia 1,3, Yi Hongchao 2, Wang Ying 1, Hu Shengshui 1,3*(1Department of Chemistry, Wuhan University, Wuhan 430072, China)(2School of Chemistry and Environmental Engineering,Yangtze University, Jingzhou 434023, China)(3State Key Laboratory of Transducer Technology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China)Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ （ＮＯ） ｐｌａｙｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ， ｂｕｔ ｉｔ ｉｓ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ＮＯ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｄｕｅ ｔｏ ｉｔｓ ｈｉｇｈ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ， ｓｈｏｒｔ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ，ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｒａｉｌｌｙ ｏｘｉｄｉｚｅｄｂｙ Ｏ２． Ｄａｔｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ＮＯ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｄｉｒｅｃｔｌｙ． Ｏｔｈｅｒ ｍｅｔｈｏｄｓ，ｓｕｃｈ ａｓ ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ＵＶ－ｖｉｓｉｂｌｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ， ａｒｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ． Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｅｓｐｅ－ｃｉａｌｌｙ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｅｎｓｏｒ ｈａｓ ｗｉｄｅｌｙ ｂｅｅｎ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ＮＯ ｉｎ ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ｂｅｃａｕｓｅ ｏｆ ｉｔｓ ｓｉｍｐｌｅ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ， ｅｘｃｅｌｌｅｎｔｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ． Ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｅｎｓｏｒｓ ｉｎｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ； ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｅｎｓｏｒ； ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ收稿日期：２００６－０６－０２基金资助：国家自然科学基金ＮＯｓ．３０３７０３９７，６０５７１０４２的支持。
作者简介：陈晓霞，硕士。
＊联系人：胡胜水，教授。
１ 引 言在过去的２０年里，一氧化氮在生物体分子信号中的作用已成为生物学中发展最快的领域之一。
一氧化氮（ＮＯ）是一种含有可以调控不断生长的生物学过程的非共享电子对的气体自由基，它由一氧化氮合成酶家族的Ｌ－精氨酸所形成。
ＮＯ在人体内分布广泛，是帮助机体抵抗心血管疾病与其他疾病的信号分子。
缺乏ＮＯ可能导致糖尿病、心血管疾病与其他疾病，而补充ＮＯ可预防和逆转此类疾病。
ＮＯ是非常小的分子，十分活泼，半衰期短，它可以进入细胞，并向周围的细胞发出交流信号。
人体很多器官都可以生成ＮＯ，比如动脉、神经等。
但是，要准确检测其在生物体中的含量很困难，因此，寻找一种实时、快速、简便检测一氧化氮的方法成为化学与医学界普遍关心的问题。
目前，常用于检测一氧化氮的方法有化学发光法（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ），紫外－可见光谱法（ＵＶ－ｖｉｓｉｂｌｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ），荧光光谱法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ），电子自旋共振光谱法（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｐａｒａ－ｍａｇｎｅｔｉｃ／ｓｐｉｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ， ＥＰＲ／ＥＳＲ），电化学方法（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ）等。
在所有的方法中，电化学方法尤其是电化学传感器具有操作简单，灵敏度高，选择性好，又可实现实时、原位检测而广泛地应用在生物医学中，并成为现代生物医学中一氧化氮的重要研究工具。
本文主要综述近年来ＮＯ电化学传感器的研制及其在生物医学中的应用。
２ 生物体系中一氧化氮的直接检测应用于生物体中的一氧化氮电化学传感器可分为两类，即直接检测型和催化检测型传感器。
直接检测型一氧化氮电化学传感器是最早用于生物体系的传感器，主要有两种，一种是Ｓｈｉｂｕｋｉ［１］制备的ＮＯ传感器。
该传感器是将长１５０－２００µｍ的铂丝插入３０ ｍＭ ＮａＣｌ和０．３ ｍＭＨＣｌ的溶液中并密封在微玻璃管内制备而成（见图１）。
二是 Ｚｈａｎｇ［２］ 等人用一氧化氮选择性气体透过聚合膜及一种阳离子交换剂Ｎａｆｉｏｎ聚合物修饰碳纤维极制备而成的传感器，２００１年他们用这种传感器首次检测到老鼠肾脏中的一氧化氮，并发现在肾切除过程中ＮＯ浓度高于其正常值。
另一类催化检测型一氧化氮传感器是基于聚合物的催化作用而制备的。
Ｍａｌｉｎｓｋｉ 等人［３］ 最先制备出聚镍－四甲基卟啉（ＮｉＴＭＨＰＰ）／Ｎａｆｉｏｎ双层复合膜修饰碳纤维电极（F ＝０．８μ ｍ， 长约６μｍ）（见图２）。
该传感器响应时间快（＜１０ｍｓ），灵敏度高（检测限达１０ｎＭ），选择性好（高于ＮＯ２０倍的ＮＯ２－不影响ＮＯ的测定），该电极已成功地应用于猪动脉单个内皮细胞中ＮＯ释放的检测。
此后，基于金属卟啉类修饰电极的一氧化氮传感器发展迅速，目前已有商品化器件，这类传感器已成为生物医学中应用最广泛的一类ＮＯ传感器。
图 ２ 镍卟啉／ Ｎａｆｉｏｎ ＮＯ 微传感器示意图１９９８年Ｂｉｒｄｅｒ等人［４］用卟啉类修饰电极制备出一种ＮＯ传感器，它可监控到肾上腺素及辣椒素作用于膀胱上皮细胞所引起的一氧化氮的释放，释放量分别是５０ｎＭ — １．４ μＭ 和 ５０ — ９００ ｎＭ，说明膀胱上皮细胞与神经细胞一样均可以释放出一氧化氮。
２００２年Ｍａｌｉｎｓｉｋｉ小组［５］用（ＮｉＴＭＨＰＰ）／Ｎａｆｉｏｎ修饰碳纤维一氧化氮传感器直接测定了不同环境下左心室壁细胞中释放的一氧化氮的含量，结果表明心室壁中心释放的一氧化氮浓度高达１．２３±０．２０ μＭ， 最低为０．９０±０．１５ μＭ。
这个检测结果有利于进一步研究一氧化氮与受损心肌之间的内在关系。
卟啉类材料构造的电化学传感器还可用于人体血小板［６］、猫骨髓［７］及其它组织［８，９］中一氧化氮含量的测量。
金属酞菁类化合物是与金属卟啉类化合物结构类似的大环化合物，１９９７年Ｏ．Ｒａｖｅｈ［１０］制备了金属酞菁一氧化氮电化学传感器并应用于活体ｍｅｌａｎｏｍａ细胞ＮＯ释放的原位检测，取得了良好的效果。
除了金属卟啉和金属酞菁类修饰电极制备的一氧化氮电化学传感器外，其它类型修饰材料也广泛地应用于一氧化氮电化学传感器的制备。
１９９８年 Ｐａｒｋ 等人［１１］制备的非导电膜修饰电极一氧化氮传感器用于老鼠脑皮细胞中释放一氧化氮的检测，并检测到两个ＮＯ信号（分别为４２２ｎＭ和７５２ｎＭ）。
实验结果证明了Ｓａｔｏ等用旋转诱捕法测试的结论，即第一个响应电流是由原生型一氧化氮合酶作用释放出的一氧化氮的氧化，第二个响应电流是诱导型一氧化氮合酶作用产生的一氧化氮的氧化。
２００５年我们小组［１２］用多壁碳纳米管修饰碳纤维电极检测了鱼线粒体中一氧化氮的含量，如图３所示，当传感器插入含有生物样品的ＰＢＳ溶液后，电流响应增加，３００ｓ后达到电流平台，该响应为生物体中内源型Ｌ－ａｒｇ在一氧化氮合酶作用下释放的一氧化氮而引起的。
在４００ｓ处加入Ｌ－ａｒｇ电流响应继续增加，几百秒后电流达到最大，该响应电流为外源型Ｌ－ａｒｇ在一氧化氮合酶作用下释放一氧化氮的响应电流。
总的一氧化氮释放量约为０．４μＭ。
同年我们小组［１３］用聚甲苯胺蓝／Ｎａｆｉｏｎ修饰玻碳电极制备出一氧化氮传感器，并应用于老鼠肝脏组织匀浆中释放的一氧化氮检测。
如图４ 所示，未加入生物样品时，在２００ｓ处加入Ｌ－ａｒｇ无电流响应，在含有生物样品的溶液中加入Ｌ－ａｒｇ后观察到一个氧化峰，该峰电流随着时间逐渐增加，在３００ｓ处达到电流平台，在约４００ｓ处加入Ｌ－ａｒｇ的同系物Ｌ－ＮＮＡ， 抑制了一氧化氮的释放，电流逐渐降低，根据最高电流响应计算出一氧化氮含量约为２２４μＭ。
图３ 加入１．０×１０－４ Ｌ－Ａｒｇ后鱼肝线粒体中释放ＮＯ的安培检测图（ａ）在ｐＨ ７．４的磷酸盐缓冲溶液中加入Ｌ－Ａｒｇ；（ｂ）老鼠肝匀浆在１．０ ｍＭ Ｌ－Ａｒｇ刺激及０．５ ｍＭ Ｌ－ＮＮ抑制下释放ＮＯ。
安培检测电压为０．８０ Ｖ．图４ 聚甲苯胺蓝／Ｎａｆｉｏｎ 修饰电极上ＮＯ的安培检测图。
３ 一氧化氮在生物体中作用的研究一氧化氮电化学传感器不仅用与生物体中一氧化氮含量的检测，也广泛用于一氧化氮在生物体中的作用研究。
１９９６年，Ｆａｒａｄｊｉ等人［１４］以镍卟啉／Ｎａｆｉｏｎ修饰碳纤维电极作为一氧化氮传感器研究了基因缺乏的癫痫病老鼠中一氧化氮浓度的变化，当一定剂量的抗癫痫药物注入老鼠体中后，检测到一氧化氮的信号增加，这一定程度上说明一氧化氮具有抗癫痫的作用。