柱前衍生化高效液相色谱等度洗脱分析单糖的方法建立徐瑾¹常州工程职业技术学院摘要以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)为柱前衍生化试剂,建立了高效液相色谱等度洗脱分离分析5种单糖的方法。
采用简化的衍生化方法,在流动相:乙腈-醋酸盐缓冲液(0.1mol/L,p H=5.5,V/V=22B78)的色谱分离条件下,5种单糖衍生物可以达到基线分离,检测限分别为0.54~0.90ng,也对方法的线性范围、精密度、稳定性进行了系统的考察。
关键词单糖1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化高效液相色谱等度洗脱1.前言近年来,糖类物质在生物学领域的作用已越来越被重视,人们将研究的重点放在糖类物质的定量、定性以及结构分析上,并对此做了大量的研究。
因为糖的种类较多,且结构近似,所以无论对哪种糖进行分析,首先必须将分析的对象与其它糖分离开来。
另一方面糖类物质几乎没有光学活性,对分离后的物质进行直接光学检测比较困难,结合灵敏度、选择性等方面的问题,人们多采用通过化学标记将糖类物质转变为具有光学活性的物质,然后再进行分离分析的方法。
衍生方法与高效液相色谱(HPLC)结合使用不但能提高检测的灵敏度,而且可以改善分离特性。
迄今为止,文献报道的用于糖类物质衍生的紫外衍生试剂种类很多[1-3],它们都各有优缺点。
近年来出现的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)是一种具有强紫外吸收的衍生试剂,Honda等[4]发现该试剂可以与还原性的糖在温和条件下反应,无需酸催化,不会引起脱甲硅基的作用,产物无立体异构体,在紫外245nm处有强烈的吸收。
该方法自应用以来,已得到了不断的完善[3-6]。
马定远等[7]在前人的基础上简化了其衍生化方法,建立了单糖组成分析的数据分析方法,并用所建立的方法对一个多糖中的单糖组成进行了分析,获得良好的重复性。
鉴于该物质的这些优点,本文采用它对单糖进行柱前衍生,结合HPLC技术,建立了5种常见单糖的等度洗脱分离模式,通过外标法对这5种单糖进行了定量研究。
2.实验部分2.1仪器UV200Ò紫外可变波长检测器;P200Ò高压恒流泵;Echrom98工作站(大连依利特科学仪器有限公司);真空过滤器(天津市腾达过滤器件厂);H19321pH计(HANNA);DZF-150型数显小型恒温真空干燥箱(郑州长城科工贸有限公司)2.2试剂乙腈、甲醇(色谱纯);三氯甲烷、乙酸铵、氢氧化钠(分析纯);PMP(99%,AC ROS);D-半乳糖、D-木糖、鼠李糖(生化试剂);葡萄糖、D -甘露糖(分析纯)2.3单糖-PMP衍生产物的制备以葡萄糖(Glucose)为例,将1mol的Glucose 溶于1.5mL的Na OH溶液(0.3mol/L)中,取该溶液150L L与100L L的PMP/甲醇溶液(0.2006年第2期总第四十八期常州工程职业技术学院学报J OUR NAL OF CHANGZ HOU INSTI TUTE OF ENGINEERING TECHNO LOGYVol.22006Jun No148¹作者简介:徐瑾,硕士。
5mol/L)混合,在70e 下反应30min 。
取出后冷却至室温,然后加入150L L 的HCl(0.3mol/L)进行中和,中和后的溶液放入真空干燥箱中,100e 下烘干。
烘干后的物质用2mL 的水及2mL 的氯仿溶解,充分振荡后除去有机相,萃取过程重复3次。
水相溶液经0.45L m 的滤膜过滤后,用水稀释至一定倍数,进样量10L L 进行HPLC 分析。
2.4HPLC 条件色谱柱:Hypersil ODS2(150mm @4.5mm i.d.,5L m,大连依利特公司);柱温:室温;流动相:A-醋酸盐缓冲液(0.1mol/L,pH = 5.5),B -乙腈;流速:1mL/min;UV 检测波长:245nm 。
3.结果与讨论3.1衍生方法的选择与其它文献[3-7]的方法不同,无需将待测样品水溶液真空干燥后再进行衍生,直接将待测样品溶解于Na OH 溶液中,衍生试验时移取一定量样品溶液直接进行衍生。
但是糖/NaOH 溶液必须在低温下保存。
因为常温下保存,数天后衍生产物的峰面积明显减小,并出现了两个杂峰,可能的原因是糖的醛基在碱性条件下容易氧化。
而低温下保存可以有效地避免这种情况的发生。
在大多数文献[3-6]中,HCl 中和衍生溶液后,首先将溶液真空干燥,再用水溶解,萃取完成后的水相再一次进行真空干燥,最后的干燥物用水溶解进行HPLC 的分析。
这些步骤以除去衍生反应中剩余的试剂和产生的杂质为目的,因此PMP 衍生方法操作复杂,无法避免各个步骤中衍生产物的损失。
有人用PMP 衍生时没有采取任何干燥步骤,直接进行萃取,多余的衍生试剂虽然没有完全除尽,但是由于衍生试剂峰在其它六种单糖的衍生产物峰前流出,所以并不干扰分离分析,这就在很大程度上简化了衍生试验的步骤,衍生产物几乎没有任何损失[7]。
本文在采用该方法时发现,在Man 衍生产物的峰后有一个小峰(P MP),等度洗脱无法与其分开(如图1a 所示)。
采取一次干燥即可解决这一问题,既达到了简化实验步骤的目的,降低了衍生产物的损失,使得定量实验更加准确,又在最大程度上使衍生试剂峰减小。
(如图1b 所示)。
图15种单糖衍生产物的色谱图Fig.1HPLC-UV chromatogram of the PMP derivatives of 5small sugars (a)without drying process (b)with drying process3.2有机萃取剂的选择柱前衍生需要使用过量的衍生试剂以达到衍生完全的目的,但必须在样品进入HPLC 之前除去过量的衍生试剂,以清除衍生试剂的干扰,延长色谱柱的使用寿命。
分别选取常用的有机试剂)))苯、氯仿、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、正己烷作萃取剂进行试验,除去衍生反应中产生的杂质和残留衍生试剂。
对衍生的最后产物使用同样体积的不同有机试剂进行萃取,比较了这5种有机萃取剂去除杂质的效果(用PMP剩余量表示)和对衍生产物的回收率(用Sugar-PMP的回收率表示)。
结果证明5种有机试剂中,氯仿在这两方面的作用是最佳的。
其用量为PMP的200倍(体积比)时,三次萃取后PMP仅剩2%,Glucose-PMP的回收率可达到82.7%。
对PMP衍生的其他单糖,如甘露糖、半乳糖、木糖等,氯仿的回收率也令人满意。
采用乙酸异戊酯分两次萃取时,虽然萃取效率低于氯仿,但各种单糖(甘露糖、葡萄糖和半乳糖)的回收情况一致,萃取各单糖峰面积的精密度在1.5%~ 3.5%之间。
采用氯仿萃取,一次萃取后鼠李糖、葡萄糖、半乳糖的回收情况基本一致,但甘露糖的回收率较高,同时木糖的回收率较低。
二次萃取后,甘露糖回收率减小。
三次萃取完成后各单糖的回收情况非常接近(在80%~83%之间),其(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖)峰面积的精密度(RSD,n=3)依次为:3.15%、2.77%、2.90%、2. 90%和2.99%。
3.3色谱分离条件的优化选用醋酸盐缓冲液作流动相,将Snyder 等[8]与卢等[9]提供的条件优化选择方案相结合,经过分离条件选择的系列试验(包括缓冲液pH值的选择,乙腈含量的选择),最终确定最佳等度分离的色谱条件:流动相A-醋酸盐缓冲液(0.1mol/L,pH=5.5),B-乙腈,A B B= 78B22(V/V),使用4.5@150mm的色谱柱, UV245nm检测,分离谱图如图1b所示。
各种单糖的衍生物色谱峰都达到了基线分离。
文献中选用流动相:A-15%(V/V)乙腈+50mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH=6.9),B-40为%(V/V)乙腈+50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH= 6.9);梯度模式:时间梯度为0min y9min y25min,相应浓度体梯度0%y10%y55%B。
应用此色谱条件,可以使上述5种单糖获得相似的分离效果。
但等度洗脱的方法相对快速简便,对色谱系统的要求不高,且重现性好,更具有普适性。
3.4标准曲线与检测限采用外标法对5种单糖进行线性考察:精确称取5种单糖的标准品适量,经NaOH溶液溶解并配制成一系列摩尔浓度的工作溶液,依次进样10L L,根据UV测定的峰面积y对相应的糖的进样浓度x(mmol/L)进行线性回归,结果见表1。
由表1可见,所测定的5种单糖的峰面积与其绝对进样量之间呈良好的线性关系。
再将最小摩尔浓度的标准溶液逐级稀释进样,计算当信噪比为3时所对应的标准溶液的质量浓度以确定检测限,得到Man、Rham、Glu、Gal和Xyl的最低检测限(LOD)分别为0.54、0.54、0.9、0.9和0.7ng。
表1五种单糖的线性范围及其最低检测限Table.1The linear range and LOD of five monosaccharides 糖相关系数标准曲线线性范围Carbohydrate C orrelation Standurd curve(n=6)Linear rangecoefficient(mmol/L) Mannose0.9995y=3656.94x-184.150.025~5.0 Rha mnose0.9997y=3924.24x-209.230.025~4.0 Glucose0.9981y=2555.54x-327.560.025~5.0 Galacose0.9978y=2663.46x-249.190.025~4.0 Xylose0.9991y=2008.36x-302.020.025~4.03.5精密度试验精密吸取5糖-PMP衍生物的标准溶液10L L,重复进样5次,甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖的精密度(RSD,n=5)分别为:0. 23%、0.22%、0.17%、0.17%、0.15%。
3.6衍生样品稳定性不采取任何干燥手段的衍生化方法,从酸中和后开始计时,16h内各衍生物峰面积的精密度(RSD,n=8)在1.6%~ 2.6%之间,能够满(下转第59页)方面,同时结合查档特点编制一些实用的检索工具,如:我院是新移址的学校,基建工程的头绪多,所以一段时间基建档案查阅人数较多,为此我们专门编制了基建档案专题目录,为查找利用者提供方便。
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5.5要主动适应当前信息时代对文件档案信息的需求。