7、包扎 塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆 扎，然后在外面用一层牛皮纸包扎。试管应 先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上 标签，注明培养基名称、日期、组别，准备 灭菌。
8、灭菌 操作流程： 检查杀菌锅各部件是否正常→加水→装 锅→加盖密封→通电加热→排空气（大量蒸汽排出 时，维持5 min）→升温→恒温杀菌→断电降温→开 盖→取出物品 培养基、无菌水等：放入高压蒸汽灭菌锅内，湿热 灭菌。 1、含糖培养基：115℃灭菌10min或113℃灭菌 15min 2、无糖培养基：121℃灭菌15～20min 玻璃器皿：干热灭菌，放入烘箱加热灭菌：160～ 165℃灭菌2h；或湿热灭菌：121℃灭菌20～ 30min。
9、搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷至50 ℃左右，将试管 棉塞端搁置在玻璃棒上，搁置的斜面长度以 不超过试管总长度的一半为宜。
10、无菌检验 将灭菌的培养基放入37 ℃的温室中培养24－ 48h，以检验灭菌是否彻底。
思考题
1、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检
查灭菌后的培养菌是无菌的？ 2、加压蒸汽灭菌的原理是什么？是否只要压力表 上的指针指到所需的压力时就能达到所需灭菌温度？ 为什么？ 3、管口、瓶口为什么要用棉塞？能否用木塞或棉 皮塞代替？为什么？




高压灭菌器的构造: 外筒:用于盛水,内有加热装 置; 内筒:置于外筒内,内由金属 隔板相隔,用于盛装待灭菌 的物品; 厚盖:盖的边缘附有螺旋,借 以紧闭灭菌器; 压力表:指示灭菌器内的温 度与压力; 安全阀:当压力达到一定值 时,可自行打开,以确保安全; 放气阀:用于灭菌过程中,放 出余气;

1、称量 除琼脂外，按培养基配方比例依次准确地称 取药品，放入适当大小的烧杯中。蛋白胨极 易吸水，称量时动作要快。
2、加热溶解
向烧杯内加入所需水量的一部 分，放到电炉上加热，同时不断进行搅拌， 使其溶解，如配制固体培养基则向溶液中加 入所需的碎琼脂，在电炉上一面加热一面搅 拌，直到琼脂完全融化后才能停止搅拌，并 加入热水补足水分。
实验 一 培养基的制备
一、实验目的 1、学习并熟练培养基的制备的方法、步骤 和技术。 2、学习和掌握高压蒸汽灭菌的具体操作方 法和技术。
二、原理
培养基是人工配制的适合于不同微生物生长繁殖或 积累代谢产物的营养基质，它是进行科学研究，生 产微生物制品及应用等方面的基础。由于各类微生 物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同， 因而培养基的种类很多，要根据培养目的和检测需 要不同，选择配制不同的培养基。 从培养基的用途来区分，培养基可分为选择培养基、 增殖培养基、鉴别培养基等。

5、分装 将培养基趁热加至漏斗上进行分装。如果要制作斜 面培养基，须将培养基分装于试管中，装试管时，装量不要 超过试管的1/5；如果要制作平板培养基或液体、半固体培 养基，则须将培养基分装于三角瓶内，一般以其容积的1/2 为宜。注意管口不要沾上培养基。

6、加塞 分装完毕后，需要用棉塞堵住管口或瓶口。 堵棉塞的主要目的是过滤空气，避免污染。 棉塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作，不 要用脱脂棉，以免因脱脂棉吸水使棉塞无法 使用。棉塞不要过紧过松，塞好后，以手提 棉塞、管、瓶不下落为合适。棉塞的2/3应在 管内或瓶内，上端露出少许棉花便于拔取。
3、调pH值
用精密pH试纸（或pH电位计、 氢离子浓度比色计）测试培养基的pH值，如 不符合需要，可用1mol/LNaOH或1mol/L NaCl进行调节，直到调节到配方要求的pH值 为止。
4、过滤
用滤纸、纱布或棉花趁热将已配好 的培养基过滤。用纱布过滤时，最好折叠成 六层，用滤纸过滤时，可将滤纸折叠成瓦棱 形，铺在漏斗上过滤。没有悬浮物的不用过 滤。
三、牛肉膏蛋白胨培养基的制备
（一）试剂和仪器 1、药品及试剂： 牛肉膏、蛋白胨、 琼脂、NaCl 、1mol/LNaOH、 1mol/L NaCl。 2、仪器用品 天平、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、 试管、三角瓶 、烧 杯、量筒、玻棒、药匙、玻璃漏斗、pH试纸（5.59.0） 、棉花、牛皮纸、记号笔、棉线、纱布、培养皿 等。 3、配方 牛肉膏3g、蛋白胨10g、 琼脂15-20g、NaCl 5g 、水 1000ml、 PH 7.4－7.6


灭菌原理： 高压蒸汽灭菌高温蒸汽导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌 的目的。适用于一般培养基、玻璃器皿、无菌水、金属用具。 一般培养基在121．3℃灭菌20分钟即可。 干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达 到灭菌的目的。与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高 （160—170℃），时间长（1—2小时）。但干热灭菌温度 不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烤焦，甚至 引起燃烧，因而一般塑料制品不能用干热灭菌。
（二）操作步骤
1.称量 称量蛋白胨要快。牛肉膏用玻璃棒蘸取放入空烧杯。 2.加热溶解 加入部分水，边加热边搅拌，溶解后再碎琼脂， 边加热边搅拌直到完全溶解。 3.调pH值 4.过滤 5.分装 装量合适、管口或者瓶口不要沾上培养基。 6.加塞 松紧合适，深浅适度 7.包扎 8.灭菌 9.搁置斜面 长度为试管的1/2。 10.无菌检查