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（三）平板划线分离法
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制备土壤稀释液
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倾注平板
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培养
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挑菌落
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接种和分离工具
1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接
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3. 培养与移植 待平板完全冷凝后，将平板倒置37℃恒温箱中培养
24～48小时，检查分离结果。将培养后长出的单个菌落 分别挑取接种到牛肉膏蛋白胨培养基的斜面上，然后置 于37℃恒温箱中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单 纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物， 若有其它杂菌混杂，就可再一次进行分离、纯化，直至 获得纯培养。
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六、作 业 1. 简述无菌操作过程中的注意点。 2. 拟出从土壤中分离细菌的主要实验步骤。 3. 如何检验平板上某个单菌落是不是纯培养？ 4. 培养时为什么要将培养皿倒置培养？
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纯化（平板划线法） 倒平板——划线——培养——挑菌落——纯种（纯培养）
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平板划线分离的方法 1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
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五、微生物实验技术操作规范示例 （一）斜面接种无菌操作技术 （二）倒平板及平板划线接种
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2. 平板制作 将无菌培养皿编上10-3、10-4、10-5号码，每一号码设
三个重复，用1ml无菌吸管按无菌操作要求吸10-5稀释液 各1ml，分别放入编号10-5的三个培养皿中。同法吸取10-5 稀释液各1ml，分别放入编号10-4的三个培养皿中。再吸 取10-3稀释液各1ml，分别放入编号10-3的三个培w1养皿中。 然后在9个培养皿中分别倒入15ml已融化并且冷却至45℃ 左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，加盖后轻轻摇动培养 皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝固后即成 平板，整个操作过程应严格按照无菌操作。
• 一、视频演示 • 二、取自己做的培养皿，观察，并作图 • 三、挑取菌落，进行革兰氏染色，初步判别革兰
氏阴性或阳性菌 • 四、将自己的培养皿、试管清洗干净，放入抽屉 • 五、作业：从土壤中分离细菌的主要实验步骤。
三、实验试剂与器材 ① 土壤样品（环境样品） ② 牛肉膏蛋白胨培养基； ③ 无菌试管、无菌三角瓶、无菌玻
璃涂棒、无菌吸管、接种环、无 菌培养皿； ④ 超净工作台
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四、实验步骤 （一） 稀释混合平板法
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1. 土壤稀释液的制备
① 称取土样10g，放入盛90ml无菌水三角瓶中，振荡15～20
大家好
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实验五 细菌的分离、接种 和培养
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一．目的要求 二．实验原理 三．实验材料 四．实验步骤 五．操作规范示例 六．作 业
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一、目的要求
掌握从环境（土壤、水体、活性污泥等）中分离和纯化 微生物的方法和原理；
倒平板； 细菌纯种分离：稀释混合平板分离法、稀释涂布平板
分离法和平板划线法； 接种技术； 无菌操作技术；
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二、实验原理
在自然界中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一 起的，为了生产和科学研究的需要，当我们希望获得某一种微生 物时，就必须从混杂的微生物类群中分离出它，以得到只含有这 一种微生物的纯培养物，这种获得纯培养物的方法称为微生物的 分离与纯化。
分钟，使微生物细胞分散，静置约20～30秒，即成10-1的土壤 悬液。 ② 另取装有9ml无菌水的试管，编号为10-2、10-3、10-4、10-5、 10-6，用无菌吸管吸取10-1土壤悬液l ml，加入编号10-2的无菌 试管中，吹吸三次，使之混合均匀，即成10-2的土壤稀释液。 再用另一支吸管吸取10-2试管中的土壤稀释液1ml，加入编号 10-3的无菌试管中，轻轻摇动，使之混合均匀，即成10-3的土 壤稀释液，一定要每次更换一支无菌吸管（连续稀释）。同 法依次分别稀释成10-4、10-5和10-6等一系列稀释度菌悬液。
种锄 8.小解剖刀
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移接斜面
常用的接种方法 划线接种 点接种 穿刺接种 涂布接种 液体接种 注射接种
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斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞
为了获得纯种的微生物，一般根据该微生物营养或培养特点 (微生物对营养、酸碱度、氧等条件)，或对某种抑制剂的耐受性不 同，或对某种环境条件要求不同，从而制作或设置一些选择性培 养基，或选择性培养条件，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板 法或划线法分离，纯化该微生物，直至得到该纯种菌株。
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（一）斜面接种无菌操作技术
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(二）倒平板及平板划线接种
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（三）平板划线接种：
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（二）稀释涂布平板法
此法与稀释混合平板法基本相同，无菌操作也一样， 所不同的是先将牛肉膏蛋白胨培养基融化，在火焰旁注入 培养皿，摇匀后制成平板，然后用三支1ml无菌吸管分别 由10-4、10-5、10-6三管土壤稀释液中各吸取0.2ml对号放入 已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻 轻地涂布均匀，然后分别倒置于37℃温箱中培养后，再挑 取单个菌落，直至获得纯培养。