❖他们都是采用放射性同位素标记探针,需要 采用放射自显影进行检测,这种检测上的限 制及当时分子克隆方法的缺乏使得DNA原 位杂交技术不能很快得到广泛应用。
❖1974 年，Evans第一次将染色体显带技术 和原位杂交技术结合起来,提高了基因定位 的准确性。
❖1975 年,Manning 等最先在溶液的分子杂交 中,使用非放射性标记,通过细胞色素C 将生 物素与RNA 分子连接起来。
FISH的基本原理
❖FISH基本原理是利用同源互补的待检染色 体与用生物素、地高辛标记过的核酸探针, 经变性- 退火- 复性,形成待检DNA与核酸探 针的杂交体。使探针与荧光素标记的特异亲 和素之间发生免疫化学反应,最后用荧光显 微镜对待测DNA进行定性、定量或相对定位 分析。
发展历史
❖1974年Evans首次将染色体显带技术和染 色体原位杂交联合应用，提高了定位的准 确性。
❖1977 年Rudkin发明了用间接免疫荧光法检 测目的DNA 的非同位素原位杂交(NISH)。
❖1981 年，Langer 等首次采用生物素标记的核苷 酸探针成功地进行了染色体原位杂交,建立了非放 射性原位杂交技术 。至此,以荧光标记的探针在细 胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。
❖1985 年，原位杂交技术被引进到植物。
荧光原位杂交演 示文稿
（优选）荧光原 位杂交
基本原理
❖根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA、 DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定条 件下能结合成双链。用放射性或非放射性 物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的 cDNA作探针，与组织切片或细胞内待测核 酸(RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用 放射自显影等方法予以显示，在光镜或电 镜下观察目的 mRNA或DAN 的存在与定位。
❖20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记 的原位杂交，即FISH技术。
❖1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列 定位到G显带标本上，标志着染色体定位技 术取得了重要进展。
❖1969 年Gall 和Pardue 以及Pardue 等人利 用放射性同位素标记的核酸探针对DNA进 行了杂交,开创了RNA-DNA 的同位素原位 杂交技术。
❖1986 年，Cremer 与Licher 等分别证实了荧光原 位杂交技术应用于间期核检测染色体非整倍体的 可行性,从而开辟了间期细胞遗传学研究。
❖20世纪90年代，随 着人类基因组计划 的进行，由于绘制 高分辨人类基因组 图谱的需 探针的制备 探针标记 杂交 （染色体显带） 荧光显微镜检测
PNA与DNA杂交时也 遵循碱基互补配对原则
❖与DNA相比，PNA对热稳定、与DNA 的结合不依赖于离子强度，因此杂交 时，受探针变性温度和溶液PH的影响 较小，鉴于这些特点和优点，PNA有 望取代DNA或RNA作为FISH的探针。 但由于PNA探针只能通过化学方法进 行合成，而且合成费用高，因此迄今 所用的PNA探针还仅限于染色体的泛 着丝粒和泛端粒探针。
荧光原位杂交
❖荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization， FISH）是在20世纪80年代 末在放射性原位杂交技术的基础上发展起 来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧 光标记取代同位素标记而形成的一种新的 原位杂交方法，探针首先与某种介导分子 (reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫 细胞化学过程连接上荧光染料。
1
放射性同位素
❖3H、35S、125I、32P等
22 非放射性物质
荧光素、生物素、地高辛等
❖同位素原位杂交的不足之处： ❖1、不稳定 ❖2、高背景 ❖3、曝光时间长 ❖4、结果统计处理繁琐 ❖5、同位素的使用和处理
几种原位杂交技术
❖1 基因组原位杂交技术 ❖2 荧光原位杂交技术 ❖3 多彩色荧光原位杂交技术 ❖4 原位PCR
探针标记
❖为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂 交，有必要对探针加以标记，以便在结合部 位获得可识别的信号。
❖荧光原位杂交得探针常用荧光素或地高辛进 行标记。
❖探针标记可以采用均匀标记和末端标记的方 法。
均匀标记
❖对探针进行标记时，可复制合成一段新探针 分子，在复制合成过程渗入标记核苷酸，从 而使整个新分子被均匀地标记。其显著的特 点是标记不局限一个位点，而是均匀地渗入， 探针的信号强。
结果分析
DNA RNA PNA
将探针置于载玻片上
在荧光显微镜下观察 检测
杂交
加盖玻片 变性
探针的制备
❖探针（probe)是指用于检测特定基 因或转录产物存在或表达的DNA、 RNA或寡核苷酸序列。
❖杂交实验所选择的核酸探针可以分 为三种：化学合成、克隆和PCR。
探针的分类
❖根据化学组成，可以将探针分为DNA、 RNA、PNA及寡核苷酸探针。
❖寡核苷酸探针 它是根据探针靶序列的碱基 顺序用化学方法合成的单链DNA，其长度 为15-20核苷酸。由于分子小，因此更容易 渗透到细胞的目标区域；但也正由于分子小， 限制了其所能携带的荧光基团或报告分子数 目，并最终导致杂交后荧光信号较弱。因此 这类探针仅实用于对重复单位较短的高度重 复序列的荧光原位杂交分析。
❖DNA探针 这类探针应用最广，可以通过化 学合成、克隆或PCR技术获得。
❖RNA探针 一般用RNA聚合酶体外转录克隆 的DNA序列获得。RNA-RNA杂交分子在所 有可能的杂交分子中最稳定，但RNA探针 容易被RNase降解。
❖肽核苷酸（PNA）探 针 PNA寡聚物是一类 新分子，其结构与 DNA相似。但在PNA 中，没有核糖-磷酸基 骨架，其骨架是不带 电的肽链(聚酰胺）。
❖均匀标记有切口平移法、随机引物法和 PCR扩增等方法。
• 切口平移法可对环状或线性双链DNA进行标记。一 般对克隆的DNA片段用这种方法标记的效果较好。
• 该方法使用时应注意： • A.只能标记双链DNA 使用探针时要预先变性后再
使用，而且标记时DNA片段不太小 • B. DNA酶I使用的量要合适 太多会将DNA模板切碎，