细菌生化试验1、实验原理（1）细菌生化试验各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。

用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。

（2）糖（醇）类发酵试验不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。

其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。

酸的产生可利用指示剂来判定。

在配制培养基时预先加入溟甲酚紫［P HS . 2 （黄色）一6 . 8 （紫色）] ，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。

气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。

（3）甲基红（Methylred ）试验（该试验简称MR 试验）很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH 降低到4 . 2 以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。

因甲基红指示剂变色范围是pH4 . 4 （红色）一pH6 . 2 （黄色）。

若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱梭，转化成醇等物，则培养基的pH 仍在6 . 2 以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。

（4）大分子物质代谢实验．靛基质（口引睬）试验某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质（叫睬），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。

硫化氢试验某些细菌能分解含硫的氨基酸（肌氨酸、半肌氨酸等），产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。

为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。

明胶液化实验某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，是为阳性。

淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不做）细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶（淀粉酶）将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖（或麦芽糖），再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。

（5）有机酸盐及氨盐利用试验柠檬酸盐利用试验柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸钠为碳的唯一来源。

而磷酸二氢按是氮的唯一来源。

有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。

此时培养基中的溟廖香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。

不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。

2、实验仪器，材料和用具（1）实验仪器37OC 恒温培养箱、20OC 恒温培养箱（室温代替）。

（2）微生物材料大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌这四种菌种的斜面各1 支。

（3）试剂甲基红试剂、V . P 试剂、叫噪试剂、格里斯试剂（硝酸盐利用试验）、卢戈氏碘液（淀粉水解试验）（4）实验用具试管：每份每个试验2 根试验，1 根对照，8 个试验共27 根。

无菌乎皿：每份2 个杜氏小管：每份6 个。

接种环、酒精灯、试管架、记号笔。

（5）培养基葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基：何份各6 支试管，何支5 一10mi 培养基，灭菌。

用于糖类发酵试验。

葡萄糖蛋白陈水培养基：每份3 支试管，何支5 一10mi 培养基，灭菌。

用于甲基红和V . P 试验。

胰蛋白水培养基：每份3 支何支5 一10mi 培养基，灭菌。

用于叫睬试验。

柠檬酸铁钱或醋酸铅的半固体培养基；每份3 支，每支5 一10ml 培养基，灭菌。

用于硫化氢试验。

营养明胶培养基：每份3 支，每支．5 一10ml 培养基、灭菌。

用于明胶液化试验。

淀粉培养基：每份2 个平皿，每平皿约20ml 培养基，灭菌后倒入平皿。

用于淀粉水解试验。

柠檬酸钠培养基：每份3 支，每支5 一IOml 培养基，灭菌，做斜面。

用于柠檬酸盐利用试验。

3、实验步骤（1）糖（醇）类发酵试验编号在各试管上分别标明发酵培养基名称，所接种的菌名和组号，下同。

接种取葡萄糖发酵培养基3 支，按编号1 支接种大肠杆菌，另1 支接种普通变形杆菌，第3 支不接种，作为对照C 同样取3 支乳糖发酵培养基，1 支接种大肠杆菌，1 支接科普通变形杆菌，第3 支不接种，作为对照。

将己接种好的培养基置37OC 温箱中培养24h 。

观察结果：被检细菌若能发酵培养基中的糖时，则使培养基的pH 降低，这时培养基中的指示剂呈酸性反应（为黄色），若发酵培养基中的糖产酸产气，则培养基不仅显酸色反应，并且在培养基中倒置的小玻璃管（杜氏小管）中有气体。

气体占整个倒置小玻管的10 ％以上。

若被检细菌不分解培养基中的糖，则培养基不发生变化。

（2）甲基红试验（MR 试验）将大肠杆菌和产气杆菌分别接种到葡萄糖蛋白陈水培养基中，37OC 培养48h ，加甲基红指示剂数滴，观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。

（3）伏一普二氏试验（V . P ．试验）将被检菌接种到葡萄糖蛋白陈水培养基中，37OC 培养48h ，取出，加入40 % KOlls 一10 滴，然后再加入等量的5 ％。

一蔡酚溶液，用力振荡，再放入37OC 温箱中保温巧一30min ，以加快反应速度。

若培养物呈现红色，为伏一普反应阳性。

（4）靛基质（口引噪）试验将被检菌接种到胰蛋白陈水培养基中，37OC 培养24h 一48h 后，沿试管壁滴加数滴叫睬试剂于培养物液面，观察结果。

出现红色者为阳性，出现黄色者为阴性。

（5）硫化氢试验：将大肠杆菌和变形杆菌以接种针穿刺接种到醋酸铅或柠檬酸铁氨培养基中，37OC 培养24h ，观察结果，若有黑色出现者为阳性。

（6）明胶液化试验取大肠杆菌和枯草杆菌的纯培养物少许，以接种针分别穿刺接种到营养明胶培养基中，置20OC 培养5 一7 天。

观察明胶培养基液化情况。

若被检细菌20 OC 不易生长，可放3 7 OC 培养，但在此温度下明胶培养基呈液状，故观察结果时，应将明胶培养基轻轻放入4OC 冰箱30min ，此时明胶又凝固。

若放置于冰箱30min 仍不凝固者，说明明胶被试验细菌液化，是为阳性。

（7）淀粉水解试验将配制好的淀粉培养基冷却到SOOC 左右，以无菌操作制成平板。

用接种环取少许枯草杆菌划线接种在平板的一边，再取少许大肠杆菌划线接种在平板的另一边。

置37OC 温箱培养24h 。

将平皿取出，打开皿盖，滴加少量卢戈氏碘液于平板上，轻轻摇动平皿，使碘液均匀铺满整个平板。

如菌苔周围有无色透明圈出现，说明淀粉己被水解。

透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的大小。

（8）柠檬酸盐利用试验取少量被检菌接种到柠檬酸盐培养基上，37OC 培养24h 后，观察结果。

培养基变深蓝色者为阳性。

培养基不变色，则继续培养7 天，培养基仍不变色者为阴性。

细菌的生化实验1．糖（醇、苷）类发酵试验(1)原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。

检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。

(2)方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。

所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表6-4-1。

将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。

若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。

(3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。

不分解糖则无变化。

(4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。

即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。

常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类单糖四碳糖：赤藓糖 , 五碳糖：核糖核酮糖木糖阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖果糖半乳糖甘露糖双糖蔗糖（葡萄糖＋果糖）乳糖（葡萄糖＋半乳糖）麦芽糖（两分子葡萄糖）三糖棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖）多糖菊糖（多分子果糖）淀粉醇类侧金盏花醇卫茅醇甘露醇山梨醇非糖类肌醇2．葡萄糖代谢类型鉴别试验(1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。

发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。

本试验又称氧化发酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。

(2)方法：挑取少许纯培养物（不要从选择性平板中挑取）接种2支HL培养管中，在其中一管加入高度至少为0.5cm的无菌液体石蜡以隔绝空气（作为密封管），另一管不加（作为开放管）。

置35℃孵箱孵育48h 以上。

(3)结果：两管培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；两管都产酸（变黄）为发酵型；加液体石蜡管不产酸，不加液体石蜡管产酸为氧化型。

(4)应用：主要用于肠杆菌科与其它非发酵菌的鉴别。

肠杆菌科、弧菌科细菌为发酵型，非发酵菌为氧化型或产碱型。

也可用于鉴别葡萄球菌（发酵型）与微球菌（氧化型）。

3．甲基红（MR）试验(1)原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解为甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培养基pH下降至4.5以下时，加入甲基红指示剂呈红色。

如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、醛、酮、气体和水），培养基pH在 5.4以上，加入甲基红指示剂呈桔黄色。

(2)方法：将待试菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育48h~96h后，于5ml培养基中滴加5~6滴甲基红指示剂，立即观察结果。

(3)结果判定：呈现红色者为阳性，桔黄色为阴性，桔红色为弱阳性。

(4)应用：常用于肠杆菌科内某些种属的鉴别，如大肠埃希菌和产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。

肠杆菌属和哈夫尼亚菌属为阴性，而沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属和变形杆菌属等为阳性。

4．β－半乳糖苷酶试验（ONPG试验）(1)原理：乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解。

有些细菌只有半乳糖苷酶，因而只能迟缓发酵乳糖，所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌均可快速水解邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG）而生成黄色的邻硝基酚。