第二十章高效液相色谱法Chapter 20 High performance liquid chromatography本章讨论高效液相色谱法的主要类型和原理、固定相和流动相及其选择、高效液相色谱仪、高效液相色谱分析方法。
本次课将重点讨论前半部分的内容，并注重与常规液相色谱、薄层色谱以及气相色谱的比较复习。
本章的结构编排比气相色谱法合理、流畅。
方法基本构架：经典LC【1964年Giddings发明了高效液相色谱法】理论参考：GC传统TLC：1、缺乏强劲驱动力，达不到“HP”；2、重现性较差；3、缺乏通用灵敏的检测器；4、由此造成的研究、生产投入的不足。
仪器化、自动化差，普及认知率相对低，恶性循环HPLC：1、以高压泵产生强劲驱动力，有了“HP”的基础；2、ODS的问世（50％以上的应用）3、仪器化、自动化，认知程度不断提高，良性循环（导致更多的优良的SP的诞生、更灵敏更强大适用面更广的检测器的诞生、仪器性能更稳定更智能）HPLC cf经典LC1、以高压泵产生强劲驱动力，快速高效（分钟计/小时计）2、SP颗粒细、均匀，C项小，柱效高（<10um/>100um）*：TLC都是“离线检测”的方法，结果较粗，效率较低。
GC都是“在线检测”的方法，结果较精密，效率较高。
3、在线检测器种类更多、更灵敏、功能更强大、适用面更广HPLC cf GC1、适用样品种类多（80％的有机化合物）【2、柱效、分析速度稍逊于GC】3、不受试样挥发性低、热稳定性差的限制4、HPLC选择MP的余地相对大，GC选择SP的余地相对大目前HPLC已发展为分析领域一项最重要的分离分析方法，涉及各大行业的各类样品。
在药学领域中，在生物样品、中药等复杂体系分析等方面举足轻重！随着与MS、NMR等联用技术的发展，HPLC的应用将愈加广泛。
第一节高效液相色谱法的主要类型和原理Classification and principles of HPLCⅠ、Classification of HPLC色谱法分类【幻灯】HPLC分类：手性色谱法-CC是从应用角度分类的，机理上包括分配、吸附或亲和色谱等；胶束色谱法-MC，电色谱法-EC的机理不属于常规的色谱机理，方法也不常用（见）。
Ⅱ、Bonded phase chromatography（BPC）BPC：普适，应用最广化学键合相优势：固定相不易流失，均一稳定，柱寿命长（GC）柱效高，分离选择性好重现性好化学键合相（chemical bonded phase, 以防止固定液流失），通常以硅胶为载体，表面化学键合了各种极性或非极性的基团，如极性的氨基、氰基，非极性的苯基、十八烷基（著名的C18或ODS）1 NPCSP极性[氨基、氰基、二醇基硅胶] > MP极性[有机溶剂]色谱机理：分配否？吸附否？分配：把有机键合层看作一层液膜，与MP之间进行分配吸附：把有机键合层看作硅胶上的“硅醇基类似物”，同样有诱导、氢键等吸附色谱的作用*：好在两种机理解释的物质洗脱顺序是一致的。
NPC Elution sequence：固定相极性>流动相极性，根据“相似相溶”，极性大的组分在SP中的溶解性大，在MP中的溶解性小，所以更容易滞留在SP 上，后洗脱。
LSC Elution sequence：强极性组分的占位能力强，与MP竞争SP吸附点位的能力强，即保留时间长，不易被洗脱。
洗脱规律：MP极性增大，竞争分配（吸附）的能力增大，组分k减小，t R 减小适用范围：溶于有机溶剂①的极性较大②的分子型③化合物①：如果不溶解则无法用有机溶剂洗脱③：如果是离子型则强烈吸附于（或分配进）SP，无法洗脱②：极性较大则易保留，达到选择性分离的效果；如果化合物极性较小，则难保留，宜用RPC。
2 RPCSP极性[C18，C8，C2，C1，Phen基硅胶] < MP极性[水-有机溶剂]色谱机理：分配否？吸附否？各种假设、各种理论，并不重要，关键是理解其洗脱规律！疏溶剂理论（Δ，了解）非极性组分或组分中的非极性部分受极性溶剂的排斥→与非极性烷基缔合“疏溶剂缔合”组分中的极性部分受极性溶剂的吸引→与非极性烷基“解缔合”→“疏溶剂缔合”与“解缔合”的竞争平衡Horvath公式（经验公式，Δ，了解）洗脱规律：（1）溶质结构溶质极性越弱，“疏溶剂缔合”越强【或“相似相溶”】，k增大，t R增大溶质引入极性基团，“解缔合”增强，k减小，t R减小（2）MP①有机溶剂比例NPC：MP极性增大，与SP竞争分配（吸附）的能力增大，组分k减小，t R减小RPC：与NPC相反！MP极性增大【甲醇或乙腈量减小而水量增加】，与SP竞争分配（吸附）的能力减小，k增大，t R增大*：教材阐述的表面张力、介电常数乃一家之言，仅作参考。
“实验表明，k的对数值与流动相中有机溶剂的含量通常是线性关系，有机溶剂含量增加，k值变小”★lg k∝1/C有机，t R=t0(1+k) 【“预测有机溶剂比例改变之后的保留值变化”有用！】②pH值变化pH值变化影响可解离物质的离解状态。
离解程度越高，极性越大，k越小，t R越小∴常用弱酸、弱碱、缓冲溶液调节pH值，抑制其解离，增加其与SP的作用，提高分离选择性和保留时间→ISCISC适于3≤pKa≤7的弱酸及7≤pKa≤8的弱碱。
提问：弱酸的pKa若<3，则抑制其解离需要的pH值太小，键合相易被破坏；同理，弱碱的pKa若>8，则抑制其解离需要的pH值（相对）太大，键合相易被破坏；提示：键合相的稳定pH偏酸，碱性条件相对易被破坏！（3）SP键合烷基长度↑（或浓度↑），疏水作用↑，溶质的k↑载体（适于在填充柱GC中使用）的钝化：为了去除表面活性作用点，防止拖尾【酸洗法：适于分析酸性化合物；碱洗法：适于分析碱性化合物；硅烷化法（去硅醇基）：适于分析易形成氢键的化合物】提问：立体位阻，残余硅醇基的吸附作用导致拖尾？适用范围：非极性至中等极性的组分提问：强极性组分根本不保留！据不完全统计：HPLC解决约80％的化合物分析；RPC解决HPLC中的约80％的化合物分析（总约64％）ODS解决RPC中的约80％的化合物分析（总约50％）3 PIC（esp RP－PIC）色谱机理：离子对模型方法核心：给有机酸、碱、盐添加一个疏水的尾巴！洗脱规律：（1）离子对试剂的种类和浓度分析酸或带负电物质：季铵盐，如四丁基季铵磷酸盐分析碱或带正电物质：烷基磺酸盐，如正戊烷基磺酸钠离子对试剂的烷基碳链长度↑，形成的离子对极性↓，溶质k↑离子对试剂的浓度↑，溶质k先↑后↓（形成胶束聚集）（2）流动相的pH值pH值使组分完全解离，最有利于完全形成离子对，k最大。
流动相的pH值对弱酸、弱碱的影响大，对强酸、强碱的影响小。
适用范围：有机酸、碱、盐，药物分析中的应用范围广泛，如生物碱、有机酸、维生素类、抗生素类等。
cf 离子交换、离子抑制、离子对色谱IEC：完全离子化的、离子型化合物ISC：可离子化的，但离子化程度偏小可抑制的PIC：可离子化的，且离子化程度偏大难抑制的Ⅲ、Other kinds of HPLC1 Ion chromatography（IC）IC是IEC相同机理的延伸。
许多无机或有机离子无紫外可见吸收，改用电导检测。
单纯用分离柱（即IEC）：亮背景中检测暗线，灵敏度低分离柱－抑制柱（IC常用模式）：暗背景中检测亮线，灵敏度高2 Chiral chromatography（cHPLC）三种方法：CSP、CMP、衍生化最常规CSP：CD（cyclodextrin），手性柱昂贵！药物手性普遍存在手性药物临床意义重大手性药物分离（制备）与手性药物合成同样挑战3 Affinity chromatography（AC）本方法在“色谱概论”章已简单讨论过，分离机理类似免疫反应（抗原－抗体的识别），是所有色谱模式中选择性最高，回收率和纯化效率都很高的方法，是生物大分子分离分析的重要手段。
*：以上IC、cHPLC、AC的固定相在下一节p430有一些描述，有兴趣的可以自行参阅，本课程不再展开，但可以作为综述、述评的内容的一部分！第二节固定相与流动相Stationary Phase and Mobile PhaseⅠ、Bonded phase（BP）of BPC固定相基本要求：（1）颗粒细而均匀（涡流扩散A＝2λd p，λ为不规则因子，d p为颗粒直径）（2）传质快（后面详细讨论）（3）机械强度高，耐高压（4）化学稳定性好，不与流动相或组分发生反应LLC的SP已基本不用（经典LC中还有使用）；LSE的SP（多孔硅胶与高分子微球）较少用；∴本节主要讨论BP（不包括“IC、cHPLC、AC的固定相”）1 Types of bonded phase（1）non－polar BP：RPCC18，C8，C2，C1，Phen基硅胶键合烷基长度↑（或浓度↑），疏水作用↑，溶质的k↑言下之意：长链烷基可使溶质的k↑（分离时间长），分离选择性改善，稳定性也更好；短链烷基使分离时间短（快速分离），当然选择性下降苯基键合相较适合于选择性分离芳香化合物（2）weak polar BP：RPC or NPC醚基或醇基，较少用（3）polar BP：NPC（RPC）氰基、氨基硅胶氰基：氰乙硅烷基，选择性与硅胶类似，更适合于选择性分离双键化合物(苯基键合相较适合于选择性分离芳香化合物)。
∵氰基硅胶极性>硅胶，∴某些硅胶不能分离的极性化合物可能可以在氰基硅胶上分离。
氨基：偏碱性，不同于酸性的硅胶，适合于选择性分离多功能基化合物，如糖类化合物；在弱酸性介质中具有弱阴离子交换能力，能分离核苷酸。
∵氨基能与醛、酮反应，∴不宜分离羰基化合物，MP中也不得含羰基化合物。
2 Characteristics of bonded phase（1）bonding reaction二甲基氯硅烷与硅胶进行硅烷化而制得[高碳ODS键合相]：*：甲基二氯硅烷产生二硅氧烷键[中碳ODS键合相]三氯硅烷产生三硅氧烷键[低碳ODS键合相]提问：哪种键合相的碳含量高？高碳ODS键合相！提问：高碳ODS键合相的载样量？大！吸附/分配能力？大！组分的保留时间？长！（2）含碳量(carbon load)和覆盖度(coverage)单/二/三硅氧烷键：高/中/低碳ODS键合相：40%——5%含碳量表面覆盖度：p424提问：哪种键合相的表面覆盖度高？低碳ODS键合相！Why？空间立体位阻小！残余硅醇基：降低非极性SP的疏水性，使分离机理复杂化（次级吸附），且影响SP的性能稳定性。
封尾：三甲基氯硅烷。
（3）固定相颗粒形状（geometry）（Δ，了解）（4）ODS的不同类型（Δ，了解）（5）键合相特点：①柱子不“娇”，耐溶剂冲洗，不易流失②化学稳定性、热稳定性好③表面改性灵活，容易获得重复性产品④载样量大注意：（1）MP的pH值应维持在2 ~ 8*：<2(2.5)硅氧烷键水解；>8（酸性的）硅胶溶解*：ISC适于3≤pKa≤7的弱酸及7≤pKa≤8的弱碱*：某些型号的ODS经过特殊处理，适应的pH值范围宽些（2）不同厂家、不同批号的同一类型键合相可能有不同的色谱特性*：硅胶来源及其处理、键合反应、封尾率等工艺无法完全重复*：报批数据实验应购置同厂家、同批号、同类型的色谱柱备用*：文献报道的色谱实验条件仅供参考ISC：常用弱酸、弱碱、缓冲溶液调节pH值，抑制可解离物质的解离，增加其与SP的作用，提高分离选择性和保留时间。