得到的结果，其内容包括蛋白质鉴定、翻译后修饰、蛋白质功能确定与 疾病的关系。
2、意义 蛋白质组学是连接基因、蛋白质和疾病的纽 带，对蛋白质表达的变化或差异的分析将具有 重要的生物学意义和医学应用价值，为阐明生 命现象的本质奠定基础。
蛋白质组学研究所面临的困难 之一
1、细胞种类的多样性 2、细胞的生命周期 3、蛋白质生成的时效性（30万－300万种） 4、蛋白质的结构与变异 5、研究方法


8． 0.5M Tris —HCl pH 6.8储液 6.1g Tris先用30ml超纯水溶解，再用46ml， 3M HCl调pH6.8,再加水定容至100ml 9． 平衡液储液 脲（即尿素） 36g 甘油 30% 30ml SDS 1% 1g 0.5M Tris—HCl pH6.8 10ml 超纯水定容至 100ml
2D-电泳实验步骤：

1. 样品的溶解 取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul 裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上 振荡10min左右，共处理一个小时。其中 每隔10～15分钟振荡一次，然后 13200rpm离心15min除杂质，取上清分 装，每管70ul，—80℃保存。
2D-电泳实验步骤：
2D-电泳实验相关试剂：

2． 裂解液 尿素 8M 硫脲 2M CHAPS 4% DTT 60 mM Tris—base 40 mM（如果有条件可以添 加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate）
2D-电泳实验相关试剂：

3. 水化液储液 尿素 8M 硫脲 2M CHAPS 4% Tris—base 40 mM
生物学问题 的提出
实验模型 的设计 感兴趣 蛋白点 的切取
实验组和对照组 样品的制备
蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离 图像扫描和初步分析
胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、微测序分析 质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现
蛋白信息的 初步获得
其它实验 的进一步 验证
蛋白质组研究平台
2D-电泳实验步骤：

3.2 点样，上胶 分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极 的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开 Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10) 胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触 加入的样品。注意：胶条使用前，要在室温中 平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气 泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应 正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样 多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线 齐平。
目前研究现状

在目前情况下，双向凝胶电泳的一块胶板 （16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测 的蛋白斑点，这与10万个基因可表达的蛋白数目相比 还是太少了。80年代开始采用固定化pH梯度胶，克服 了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非 常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。由于可以建立 很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对特别感兴趣的区域可 在较窄的pH范围内做第二轮分析，从而大大提高了分 辨率。此种胶条已有商品生产，因此基本上解决了双 向凝胶电泳重复性的问题。这是双向凝胶电泳技术上 的一个非常重要的突破。第二向SDS-PAGE有垂直板电 泳和水平超薄胶电泳两种做法，可分离10～100kD分子 量的蛋白质。
2D-电泳实验步骤：

3.4 平衡 用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后，在滤纸上吸干（胶面， 即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条 要将两头剪去），再以超纯水冲洗，滤纸吸干（再次 冲洗过程也可省略），然后用镊子夹住胶条以正极端 （即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上，放入 用来平衡的试管中（镊子所夹的是碱性端，酸性端留 有溴酚兰作为标记），用平衡液A，平衡液B先后平衡 15min。 注:平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触 平衡管壁。 平衡第二次时，在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样 大小的小纸片，长度与一向胶条的宽度等同，然后吸 取煮好的Marker，转入SDS—PAGE胶面上，保持紧密 贴合；同样在第二次平衡时，煮5%的琼脂糖10ml。

2. Bradford法测蛋白含量
2D-电泳实验步骤：

3. 双向电泳第一向—IEF（双向电泳中一律使 用超纯水） 3.1 水化液的制备 称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后, 加入8ul 0.05% 的溴酚兰，3.5ul（0.5%v/v） IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离 心15min 除杂质，取上清。 在含300ug 蛋白（经验值）的样品溶解液中加 入水化液，至终体积为340ul， 振荡器上振荡 混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。
2D-电泳实验相关试剂：


4. 分离胶buffer (pH8.8) 250ml SDS 0.4% 1g Tris—HCl 1.5M 45.4275g 5. 浓缩胶buffer (pH6.8) 100ml SDS 0.4% 0.4g Tris—HCl 0.5M 6.07g
2D-电泳实验相关试剂：
样品制备：

用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其 他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻 干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。充分溶 解后，离心去除不溶杂质。
配胶：

胶液组成：6ml胶母液（10％） 6－8％尿素 1ml Ampholine (pH3.5-10) 60-80ul 10%AP 5 ul TEMED 灌胶：配好的胶迅速灌入模具
固定：染色：脱色


固定：取出塑料片，放入固定液中15min 染色：取出塑料片放入染色液中65℃染 色，直至条带出现 可脱色至背景消除后干燥保存。
注意事项
1、 两性电解质是等电聚焦的关键试剂，它的含 量2﹪-3﹪较合适，能形成较好的pH梯度。 2、 丙烯酰胺最好是经过重结晶的。 3、 过硫酸铵一定要新配置。 4、 所有水用重蒸水。 5、 样品必须无离子，否则电泳时样品带可能走 歪，拖带或根本不成带。 6、 平板等电聚焦电泳的胶很薄，当电流稳定在 8mA，电压上升到550V 以上，由于阴极飘移， 造成局部电流过大，胶承受不了而被烧断
分离
①、等电聚焦：电荷 ②、SDS凝胶电泳：分子大小
二维电泳方法与问题

方法的主要步骤：
1、 样品准备 2、第一维：形成pH梯度进行等电聚焦 3、第二维：SDS凝胶电泳 4、染色： 考马氏亮兰或银染 5、图像分析：肉眼或自动扫描
过程演示

双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白 质的等电点不同用等电聚焦分离，第二 向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离， 把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平 面上分开。
二维电泳技术介绍
广州大学生命科学学院 柯德森
主要内容
一、蛋白质组学研究意义与面临的困难 二、二维电泳及其重要性 三、二维电泳的方法与存在的问题 四、二维电泳的进展 五、展望
蛋白质组学研究的意义
1、定义：
蛋白质组(proteome) ：一个细胞在特定生理或病理状态下表达的
所有种)：指研究蛋白质组的技术及这些研究所


6. 凝胶储存液（30%的丙烯酰胺） 250ml Acr 29.2% 73g Bis 0.8% 2g 7. 电极缓冲液（跑一次要配制2500ml） 甘氨酸 43.2g 36g Tris 9g 或 7.5g SDS 3g 2.5g 超纯水定容至3000ml 超纯水定容至2500ml
2D-电泳实验相关试剂：
2D-电泳实验步骤：

4. 双向电泳第二向—SDS-PAGE 4.1 配胶(两根胶条所用剂量) 分离胶：（T=8% 80 ml）：溶液于真空机中抽气后再 加APS和TEMED 30 % 丙烯酰胺储液 21.28ml 分离胶buffer 20ml 10%APS 220ul TEMED 44 ul 双蒸水 38.72ml 浓缩胶：（T=4.8% 10ml） 30 % 丙烯酰胺储液 1.6ml 浓缩胶buffer 2.5ml 10%APS 30ul TEMED 5ul 双蒸水 5.9ml
2D-电泳实验步骤：

4.3 转移 剪两个小的滤纸片，吸取Marker后，放入 SDS—PAGE胶面的一端。然后，将平衡好的 IPG胶条贴靠在玻璃板上,加少量的5%的琼脂 糖溶液在胶面上(琼脂糖凝胶在转移前十几分 钟的时候配好,水浴加热溶解,并保持烧杯中水 处于沸腾状态,至用之前再拿出来),再将IPG胶 条缓缓加入SDS—PAGE胶面,其中不断补加5% 的琼脂糖溶液,注意不能产生气泡。
电泳：

等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将 塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。 在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的 电极条。在胶面上任意位置上放上小擦 镜纸片，在纸片上加样，盖上盖子，横 功率25W电泳，约10min后，暂停电泳， 取下纸片，继续电泳约30min，待电流达 4mA以下，停止电泳。
蛋白质组研究平台

蛋白组学的发展依赖于双相电泳技 术的发展、电喷雾质谱（ESI-MS） 和基质辅助激光解吸飞行时间质谱 （MALDI-TOF-MS）技术的发明以及 在蛋白质分析中的应用和蛋白组信 息学的兴起。
二维电泳及其重要性
1、定义：二维电泳是将不同种类的蛋白质按照 等电点和分子量差异进行高分辨率的分离分 析方法。成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行
2D-电泳实验步骤：

3.3 IPG聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为 20℃） S1 (30v, 12hr, 360vhs, step) S2 (500v, 1hr, 500vhs, step) S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step) S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad) S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step) 共计 44110vhs, 19.5小时 其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离 子，S4和S5用于聚焦