多酚氧化酶特性研究摘要: 采用分光光度法, 对板栗仁多酚氧化酶( PPO) 的催化特性、最适波长、最适反应时间、最适温度、最适pH 值、热稳定性等性质进行了研究, 同时研究了Vc、EDTA、NaCl、柠檬酸4种添加剂对板栗仁多酚氧化酶活性的影响。

结果表明: 板栗仁多酚氧化酶催化氧化产物的最大吸收波长为410nm, 最佳反应时间为3min, 最适反应温度为30℃, 最适pH 值为6. 0, 米氏常数Km = 0.0694mo l/L, Vmax = 3.918OD/min。

95℃水浴处理5min该酶已基本失活, 其中V c 和EDTA对板栗仁多酚氧化酶酶促褐变有很好的抑制效果。

关键词: 板栗; 多酚氧化酶; 褐变; 抑制多酚氧化酶( Polyphenolox idase, PPO ) 是由核基因编码的铜金属酶, 其酶促褐变机制是: 内源性酚类物质在多酚氧化酶的催化下氧化生成醌, 醌再相互作用生成高分子聚合物, 从而导致褐色素的生成。

它能催化两类不同的反应, 可以使一元酚羟基化, 生成相应的邻二羟基化合物;也可以氧化邻苯二酚生成醌[ 1]。

而酚类物质是果疏组织褐变的物质基础, 不同植物、同一植物的不同组织, 同一植物的不同品种、生长环境以及不同的发育期, 其褐变的主要酚类物质均有所不同, 导致酶褐变活性也有所差异。

云南富产板栗, 但对板栗仁PPO 的活性及影响活性因素的研究则未见报道。

1材料与方法1.1材料板栗市场购外观良好, 无病虫害, 无机械损伤新鲜的云南板栗。

1.2试剂与仪器主要试剂: 聚乙烯吡咯烷酮( PVPP)、邻苯二酚、乙酸钠、冰乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甲醇、乙醛、盐酸、维生素C ( V c)、EDTA、柠檬酸、氯化钠等, 均为国产分析纯。

主要试验仪器: TGL - 16G 高速台式冷冻离心机、722W 型分光光度计、HH - 4型数显恒温水浴锅、冰箱等。

1.3试验方法1.3.1粗酶液的制备酶液提取参照文献[ 2] 的方法, 有所改进。

称150g 冷冻鲜样, 加入PH 值6.0 的0.05mol /L冷冻磷酸缓冲液150mL 和15gPVPP, 打浆, 过滤, 于3℃下12000r /min 离心15min, 取上清液置于0~ 4℃保存备用。

1.3.2褐变度( BD) 的检测称5g 样品加入15mL 蒸馏水中研磨, 离心( 14000r/min、15min)。

沉淀溶于15mL甲醇甲酸溶液(体积比1:1), 充分浸提15min 后离心。

将两次所得上清液混匀后用蒸水定容为25mL, 离心, 取上清液检测410nm 下的吸光值An ×10 表示。

1.3.3总酚( TP) 的提取和含量检测称取5g 样品, 加入15mL 乙醛- 盐酸溶液( pH3.0) 研磨, 在恒温水浴中震荡1h, 取出离心15000r /min, 30min, 量取滤液体积, 吸取5mL, 用蒸水定容到50mL, 测定A 值, 用邻苯二酚做标准曲线。

1.3.4酶活性的测定取2mL 0.2mol/L 邻苯二酚溶液和2mL一定pH值的磷酸缓冲溶液加入到试管中, 然后加入0.5ml的粗酶液, 水浴保温3min后立即倒人比色管中, 在410nm波长处测定反应混合液的吸光值变化(△A), 每30s读数1次, 共记录3min。

空白用蒸馏水代替邻苯二酚。

酶活性以1min△A 值为每增加0.001 为1 个活力单位( U )。

检测410nm 下的吸光值表示为A = U ×100。

2结果与分析2．1工作波长的选择体系反应产物在可见光波350 ~ 470nm 下的吸光度见图1所示。

图1 PPO酶促反应体系每隔3m in的波长扫描图。

由图1可以看出在从350nm 后昅光值一直呈下降的趋势, 但当反应液在410nm处时吸光度值便出现上升, 并从最初3min 的约0.527 升到9min的约0.638, 随着时间的延长反应液在410nm 处的吸光度值逐渐增大。

当反应15min后吸光度值已经增大到接近0.87, 并形成一个大的波峰, 说明该酶促反应的产物最大吸收波长在410nm 处, 故以此波长处的吸光度来衡量PPO 酶促反应速度的大小。

2．2 PPO的活性测定以1.3.4 中所述的方法进行PPO 活性的测定, 其结果见图2所示:在5min内, 随着时间的延长吸光值也随之增大, 在反应达3min时吸光度的变化达到最大, 此后增长趋于平稳。

因此试验的测定均采用反应3min时410nm处的OD值表示PPO的活力。

图2 ppo反应进程曲线2.3总酚含量与褐变度的关系按照1.3.3中总酚测定方法测定, 以邻苯二酚浓度为纵坐标, 吸光度为横坐标, 总酚标准工作曲线见图3。

图3总酚含量工作标准曲线由于吸光值越大说明褐变越厉害 , 由图3可以看出, 总酚含量与褐变度的关系为直接相关, 而相关系数很大( R2 = 0.9692), 说明总酚含量与褐变度有很大的相关性, 说明褐变主要是酚类底物的氧化引起的。

2.4 PPO活性与褐变度的关系通过线性方程法得到PPO活性与褐变度的关系, 结果见图4。

图4 ppo活性与褐变度的关系由图4可以看出, 板栗仁中PPO 活性与褐变度相关系数很大( R2 = 0.9369) , 说明板栗仁中的PPO 活性直接影响到褐变度的大小, 结合2.3结果, 充分说明板栗仁的褐变主要为PPO 引起的酶促褐变。

2.5底物浓度对PPO活性的影响由图5可以看出, 底物(邻苯二酚) 浓度与PPO 活力的关系表现为: 当底物浓度低于0.03mo l/L时, 酶活性(酶促反应速度) 随底物浓度增加而直线上升; 当底物浓度大于0.07mol/L时, 反应速度的增加变慢; 当底物浓度远大于Km时, 反应速度则趋向于最大值Vmax 。

图5底物浓度对ppo活性的影响根据上述描述可知, 板栗仁多酚氧催化反应过程中, 反应速度与底物浓度之间的关系可化酶催化反应过程符合米氏方程所描述的单底物酶促反应动力学, 其用L inew eaver— Burk方程:1 /V = Km ×1/ [ S] + 1 /Vmax, 求得此条件下的Km及Vmax值。

然后以1 /V 对1 / [ s] 作图如图6所示。

图6 Lineweaver- Burk曲线图6中直线在横轴及纵轴的截距可分别求得Km = 0.0694mol /L, Vm ax = 3.918OD /min米氏常数Km是酶的一个基本特征常数, 它反应了酶与底物结合和解离的性质, Km值越小说明底物与酶结合的亲和力越强。

2.6不同因素对PPO活性的影响2.6.1 pH 值对PPO活性的影响以1.3.4d的方法进行试验, 结果如下。

图7 pH值对ppo活性的影响从图7可以看出, 以邻苯二酚为底物时, 反应体系的pH 值对板栗多酚氧化酶活力的影响比较明显。

pH 值在4.5 和6.0时, 分别有两个顶峰, 但比较而言以pH 值为6.0 的酶活性最高。

当pH 为3.0 时, 酶活性仅为pH6.0 时的30% 。

当pH 值小于3.0 或者大于8.0时, PPO 几乎丧失活力。

据推测这一方面可能是由于PPO 的辅基是Cu+ 2, 在强酸性条件下, 酶中的铜离子被解离出来, 使酶失去活性。

在强碱条件下, Cu+ 2转化为Cu ( OH ) 2沉淀, 脱离了酶蛋白, 也能使酶失去活性; 另一方面是由于反应体系的pH 值对底物的解离使之不能被催化反应。

因此, 调节pH值能有效抑制PPO 的活力。

2．6.2温度对红枣PPO活性的影响2．6．2．1不同温度下PPO 活性的比较由图8可以看出, 温度在30℃时板栗仁中PPO 活性最图8温度对ppo活性的影响强, 在10℃ ~ 30℃范围内随温度的升高活性增加, 在温度高于30℃时, 随着温度的升高, 酶活性降低。

所以说通过提高温度或者降低温度可以抑制酶的活力。

温度对PPO 的影响是双重的, 一、方面温度升高能加快酶催化反应速度进程, 另一方面促使酶蛋白变性。

2.6.2.2 PPO的热稳定性按照1.3.4的方法进行试验, 结果见图9。

图9不同温度处理对ppo活性的影响由图9可以看出, PPO 的热失活速度随着温度的升高而加快, 在95℃条件下, 5m in左右酶活性几乎全部被抑制。

在85℃条件下, 加热7min后仍然有10%的活性存在。

在75℃条件下, 加热25min仍有10% 的酶活性存在。

2.7不同抗褐变剂对酶活性的影响2.7.1 VC对酶活性的影响选用不同浓度的VC 按照1.3.4所述方法进行试验, 结果见图10。

图10 VC 对ppo活性的影响由图10可知, 随着VC 浓度的加大, 多酚氧化酶活性逐渐下降,在VC浓度为0.1% 时, 残余酶活性只剩下2%。

VC 不仅是多酚氧化酶辅基铜离子的螯合剂, 而且也是多酚氧化酶作用底物的竞争性抑制剂。

此外, VC 还可以还原多酚氧化酶作用所形成的醌。

2.7.2柠檬酸对PPO 活性的影响选用不同浓度的柠檬酸按照1.3.4所述方法进行试验, 结果见图11。

图11柠檬酸对ppo活性的影响由图11可以看出, 随着柠檬酸浓度的增大、对PPO的抑制作用也随之增大, 柠檬酸的浓度为0.1%时, PPO 的活性是1% 的3 ~ 4倍。

这充分说明高浓度的柠檬酸对酶促褐变有一定的抑制作用。

低浓度的柠檬酸不能络合足够的铜辅基, 而高浓度的柠檬酸可使体系pH 降低, 使之远离PPO最适pH 值而降低活性, 同时柠檬酸的3 个羧基有较强的鳌合PPO铜辅基而达到抑制PPO 活性的作用。

2.7.3 EDTA 对PPO 活性的影响选用不同浓度的EDTA 按照1.3.4所述方法进行试验, 结果见图12。

图12 EDTA对ppo活性的影响EDTA 是一种金属离子鳌合剂, 可以与大多数金属离子, 如铜、铁离子等鳌合。

所以可抑制金属离子对板栗仁PPO 活性的促进作用而引起的酶褐变, 而且还有降低体系pH 值的作用。

图12表明, 随着EDAT 浓度的增大, 对PPO 活性的抑制作用一直在增强, 当浓度低于0.03% 时, 抑制率随着浓度的提高增长较快, 当浓度达到0.08%时, PPO相对活性为降到了原来的10% 。

2.7.4. NaCl对PPO 活性的影响选用不同浓度的NaCl按照1.3.4所述方法进行试验, 结果见图13。

图13氯化钠对ppo活性的影响由图13可以看出随着NaC l浓度的增大, PPO的相对活性呈下降趋势, 但是相对趋势比较平缓,在NaCl浓度为0.7% 时, PPO 的相对活性基本保持不变。

可见, NaCl对PPO 的抑制作用不强。

3结论1.充分说明板栗的褐变主要为PPO引起的酶促褐变, 板栗多酚氧化酶对底物邻苯二酚酶促反应的反应产物的最大吸收波长为410nm。