细胞因子检测细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质分泌的蛋白质,在体广泛参与免疫调节及炎症反应、组织修复、刺激造血系统、刺激细胞的增殖与凋亡等重要生理活动,•在抵抗外来病原及维持机体环境平衡中均起重要作用。
某些刺激因子也可导致一些细胞因子超量表达,或表达减少,从而参与疾病的发病及病理过程。
1、免疫学检测法其基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。
•如免疫斑点法、ELISA法、RIA法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。
2.、生物学测定法其原理是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株(即靶细胞)•的促增殖作用,以增殖细胞中的DNA的合成或酶活性为指标,间接推算出细胞因子的活性单位,如对IL-1、IL-2等细胞因子活性的检测。
亦可根据某些细胞因子对特定靶细胞的杀伤效应或对病毒的抑制作用进行测定,如对肿瘤坏死因子及干扰素的生物活性测定。
3、分子生物学测定法目前采用的技术有各种印迹法、斑点杂交、原位杂交和PCR等。
通过检测细胞细胞因子的基因组成或mRNA量,推算出细胞因子的合成量。
..一、IL-1的检测(生物活性测定)产生IL-1的细胞种类很多,其中最主要的为单核-巨噬细胞。
IL-1可分为IL-1α(•也称酸性IL-1,pI=5.0)和IL-1β(中性IL-1,pI=7.0)。
两者的分子量和生物活性相似,•只能用抗体检测方法才能区别,常用的生物学测定法对两者都适用。
IL-1•的生物学活性广泛,其检测方法亦较多,包括有小鼠胸腺细胞增殖法、D10G 4.1细胞增殖法及L929细胞增殖法等。
IL-1反应细胞增殖可以通过活性染料染色,显微镜直接计数,3H-TdR或125I-UdR的DNA掺入量或以活性细胞代率为指标来表示。
本试验介绍L929细胞增殖MTT比色法。
（一）IL-1的诱生体外试验可用LPS等有丝分裂原诱导单核-巨噬细胞产生IL-1,或用P388D1(鼠),THP-1(人)细胞株制备IL-1。
本试验以小鼠巨噬细胞制备IL-1。
1、取6～10周龄BALB/c或C57BL/6小鼠,雌雄均可,拉颈处死后用酒精消毒。
2、用带9号针头的5ml注射器腹腔注入5ml冷的含5％小牛血清的Hanks液(5•％•NBS-HBSS),轻揉腹部吸出腹腔液体(含腹腔细胞),反复抽吸几次。
..3、1500r/min离心8min,洗细胞2次。
4、将腹腔细胞用含10％小牛血清的RPMI-1640液(10％NBS-RPMI-1640)配成2×106/ml,加到24孔平底培养板,1ml/孔,置5％CO2,37℃温箱孵育2h。
5、每孔用5％NBS-HBSS洗3次,弃去未粘附细胞,贴壁细胞为巨噬细胞单层。
6、将LPS(10μg/ml)加入巨噬细胞单层,每孔1ml,培养4h；加入10％NBS-1640 •1ml继续培养至48h,收集上清液,置-20℃冰箱保存,待测IL-1活性及含量。
（二）L929细胞增殖MTT比色法MTT比色分析法的原理是利用四甲基偶氮唑盐[3-(4.5-dimethylthiazol-2-y1)-•2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下,被还原成兰黑色的MTT-甲,形成MTT-甲的量与细胞增殖程度呈正相关。
•故通过测定细胞形成MTT-甲量,可间接定量分析细胞的增殖情况,具体步骤如下:1、将生长成单层的L929细胞用0.25％胰酶消化2～3min。
除去消化液后,用10% FCS的RPMI-1640将L929细胞配成1×105/ml,加入96孔细胞培养板中,每孔100μl。
..2、取100μl不同稀释度的IL-1标准品和待测品,分别加入各孔中,每孔设3个复孔•,置37℃,5% CO2温箱孵育56h。
3、用PBS溶解MTT为5mg/ml,用0.22μm膜滤器除菌及杂质。
4、上述培养体系取出后,每孔加入10μl MTT(5mg/ml),37℃继续培养4h。
5、从每孔吸出100μl上清弃去,加酸化异丙醇或加DMSO 100μl/孔,•充分混匀以溶解底物。
酸性条件使培养液中酚红指示剂变为黄色,以利于对MTT-甲转化物的测定。
6、将微量测定板置室温数分钟,保证转变的底物结晶被溶解。
7、用酶标光度计以检测波长为570nm,参考波长为630nm分别测量OD值。
测定应在酸化异丙醇加入后1h完成。
OD570nm－OD 630nm,再减去培养液对照的OD值。
8、用IL-1标准品各稀释度IL-1含量(X)和各稀释度对应的OD值(Y)作直线回归,按上述概率单位分析法计算待测样品IL-2的活性单位(u/ml)。
（三）注意事项..1、IL-1诱生剂的浓度,培养条件和细胞浓度对结果均有明显影响,•应进行预试验以确定最佳实验条件。
2、培养器皿和研磨条件：24孔培养板培养细胞活率较高,但生长稍慢。
玻璃瓶培养有时会因玻璃质量和清洗不净引起细胞死亡,故应注意采取相应措施。
•大量培养时用大容量瓶比较方便,可减少操作中的污染。
研磨组织可用玻璃匀浆器、不锈钢网。
二、TNF的检测(免疫学测定法,双抗体ELISA夹心法)（一）原理选用两种针对rHuTNF-α分子不同表位的单克隆抗体,一种单克隆抗体作为包被抗体,另一种单克隆抗体作为酶标抗体,如果待测样品中含有TNF-α,则形成抗体-TNF-α-酶标抗体复合物,通过酶催化底物显色,亦可根据标准品OD 值绘制标准曲线,•从标准曲线上查出待检标本中TNF-α的含量。
（二）材料和试剂1、包被抗体: 使用时用包被缓冲液作适当稀释。
2、酶标抗体: 使用时用稀释液作适当稀释。
..3、标准品: rHuTNF-α(10ng/ml),使用时用稀释液作倍比稀释。
4、阴性对照液(未免疫鼠Ig)。
5、ABTS底物:2,2'-Azino-bis-(3-ehtylbenzthiozoline 6-sulfonic acid)•,•2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯呆-6磺酸)。
6、96孔ELISA板。
7、0.15mol/L,pH7.4 PBS:配其它液体用。
8、包被缓冲液: 0.05mol/L,pH9.6 Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
9、洗涤液: 0.05％Tween 20-PBS。
10、稀释液:4％PEG-洗涤液(用于稀释标准品和酶标抗体)。
11、底物缓冲液:0.1mol/L,pH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。
12、3％H2O2。
..13、血清、枸缘酸盐或EDTA抗酸血浆、其它体液及细胞培养上清均可检测,•后者应作适当稀释。
14、ELISA读数仪等。
（三）操作步骤1、包被将稀释好的包被抗体加入ELISA板,100μl/孔,4％放置24h或48h。
2、加待检标本洗涤液冲洗ELISA板3次,加待测样品、阴性对照及倍比稀释的标准品,100μl/孔,37％,1h.标准品稀释方法:取标准品150μl(10ng/ml)倍比稀释7个浓度:5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、625pg/ml、312pg/ml、156pg/ml和78pg/ml。
3、加酶标抗体:洗板3次,加入稀释好的酶标抗体,100μl/孔,37℃,1h。
4、显色:洗板3次,加入配好的ABTS显色液,100μl/孔,室温或37℃显色15～30min。
..5、ELISA读数仪测410nm处OD值,绘制标准曲线。
6、从标准曲线查得待测样品中的TNF-α含量。
四、注意事项1、血清或血浆中残存凝块或红细胞须经离心去除,勿用溶血或脂肪过多的血清。
2、标本在2～8℃可储存3天,超过3天应放入-20℃或-70℃,避免反复冻融.3、分别用加样器头吸取各份标本,避免相互交叉。
4、叠氮钠(NaN3)对辣根过氧化物酶(HRP)有灭活作用,在本实验系统中应避免使用。
5、底物显色液必须临用时配制,双氧水应放置在2～8℃,保存6个月以。
附: 试剂配制1. 0.15mol/L,pH7.4 PBS..KH2PO4 0.2gNa2HPO4·12H2O 2.9gNaCl 8.0gKCl 0.2g双蒸水加至100ml2. 包被缓冲液Na2CO3 1.59gNaHCO3 2.93g双蒸水加至1000ml3. 洗涤液PBS 1000ml..Tween 20 0.5ml4. 稀释液洗涤液100ml鸡蛋清0.6mlPEG (聚乙二醇,MW6000) 2.0gNaCl 2.9g5. 底物缓冲液Na2HPO4·12H2O 1.79g拧檬酸1.29g双蒸水加至100ml6. ABS显色液..ABTS 5mg底物缓冲液10ml3％H2O2 20μl三、IL-2的检测(基因的检测)细胞因子基因的检测包括对其DNA的检测和mRNA表达的检测,常用的方法有Southern印迹,斑点印迹,PCR,原位杂交及原位PCR等,Northern印迹及RT-PCR。
本文介绍IL-2mRNA的测定(斑点杂交法)。
将RNA变性后直接点样于硝酸纤维膜上,可用手工操作点样,•也可用斑点式点样器点样,再与特异性探针进行杂交。
•本法可用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及半定量分析。
由于其操作比Northern印迹简单、迅速,所需样品量少,且可在同一膜上同时进行多个样品的检测,故很适合于临床应用。
亦可用于DNA的检测。
但其缺点是不能鉴定所测基因的分子量。
（一）主要试剂1. RNA提取试剂:TRIZOL试剂(Gibcol,No.15596-026),DEPC水(Fluka,No.980210)..2. 质粒提取试剂盒:(Promega:Wizard Minipreps DNA,No.117)3. DNA片段提取试剂盒:(La Jolla)4. 地高辛标记和检测试剂盒:(Boerhinger Mannheim,No.1093657)5. IL-2 DNA探针6. 其他试剂（1) STE溶液0.1mol/L NaCl10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)（2) 溶液Ⅰ50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris.Cl(pH 8.0)10mmol/L EDTA(pH 8.0)..可配100ml,高压灭菌15min,贮存于4℃（3) 溶液Ⅱ0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液稀释)1%SDS (配20%贮存液)盖紧瓶盖,颠倒离心瓶数次,以充分混匀容物.于室温放置5～10min （4) 溶液Ⅲ5mol/L 乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液对钾是3mol/L ,对乙酸根是5mol/L（5) 含相应抗生素的LB培养基（6) 氯霉素(0.25g/2ml)--->终浓度170μg/ml（7) 溶菌酶(10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl pH8.0) 1ml..（8) 无水乙醇(部分-20℃预冷).异丙醇.75%乙醇(部分4℃预冷)（9) TE缓冲液(pH8.0)（10)5mol/L LiCl 1.5ml（11)RNA酶,RPMI-1640,胎牛血清(FCS),ConA(刀豆蛋白A)等（12)500μl 含13%(W/V)聚乙二醇(PEG 800)的1.6mol/L NaCl （13）3mol/L NaAc、饱和酚、氯仿:异戊醇(24:1)（二）主要仪器CO2培养箱:美国Forma Scientific产品;无菌操作台:净化设备公司产品;图象处理分析仪:同济医大太阳公司产品;低温高速离心机:离心机械研究所...（三）IL-2质粒DNA探针的大量制备1、含IL-2质粒DNA探针的提取取含IL-2质粒DNA的单个菌落置两个25ml LB培养基(含100μg/ml Amp)↓37℃220r/min 振摇过夜(约16h)取10ml菌液加200ml LB培养液(含100μg/ml Amp)↓37℃150r/min 振摇4h加氯霉素(终浓度170μg/ml)↓37℃220r/min 振摇3h菌液倒入300ml离心管中离心↓4℃5000r/min×10min离心弃上清除去残液(吸水纸无菌)每管加40ml STE溶液(冰预冷)悬浮细菌后,用移液管转入到50ml离心管中..↓4℃5000r×15min离心弃上清,加5ml溶液Ⅰ(冰预冷)悬浮细菌,加1ml新配制(pH8.0)的溶菌酶(10mg/ml)↓轻摇,室温静置5min加10ml溶液Ⅱ,盖上盖子,将离心管小心颠倒数次混匀液体,不要用旋涡振荡器↓冰浴10min,且勿摇动加7.5ml溶液Ⅲ(冰预冷),轻振荡离心管数次使之混合↓冰浴20～30min,使沉淀完全,4℃12000r/min×20min离心取上清到另一50ml离心管中,加0.6体积异丙醇,混匀,室温静置15min↓室温5000r/min×15min离心弃上清用75%乙醇洗涤沉淀一次(不将沉淀悬浮),倒出乙醇,倒置吸水纸上,使乙醇挥发..用1.5mlTE(pH8.0)将沉淀溶解,加等体积冰预冷的5M LiCl,混匀后置冰浴10min↓4℃12000r/min×10min离心取上清至新EP管, 加等体积的异丙醇(约3ml),充分混匀,室温静置15min↓室温12000rmin×10min离心(回收沉淀的核酸)小心去上清,将管倒置以使最后残留的液滴流尽,用75%乙醇洗涤沉淀,流尽乙醇,•用吸纸吸去附于管壁的液滴,将管倒置在纸巾上数分钟,以使最后残余的痕量乙醇蒸发用500μl TE(pH8.0)溶解DNA沉淀,移至新EP管中,加入RNA酶(终浓度100μg/ml)↓37℃水浴30min加等体积(500μl)含13%(W/V)PEG(800)的1.6mol/L NaCl,充分混合↓4℃12000r/min×5min离心..吸去上清,用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀加等体积饱和酚(400μl)混合↓12000r/min×10min离心吸上层水相移至另一EP管,加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)剧烈混匀呈乳白状↓12000r/min×10min离心吸上层水相移至另一EP管,加等体积氯仿:异戊醇(24:1)混匀↓12000r/min×10min离心吸上层水相移至新EP管(硅化),加入0.1体积的3mol/L NaAc(pH5.2)和2体积的-20℃预冷的无水乙醇,混匀(可见沉淀出现),置-20℃2h或0℃20min↓4℃12000r/min×15min离心弃上清,加75%乙醇(4℃预冷)200μl,稍加振荡,离心洗涤2次..↓4℃12000r/min×5min离心去上清敞开管口,将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽溶沉淀于11μl TE溶液中↓↓取1μl电泳其余进行酶切2.、经0.7％琼脂凝胶电泳,确定有质粒DNA后,用XhoI进行酶切。