转化率＝
转化子 DNA分子数
＝
Ca2+诱导大肠杆菌转化法
① 低温下使磷质层形成液晶结构， Ca2+： 使膜间核酸酶分离 ② 与DNA结合，抗DNase
（1）感受态的制备
对数生长后期的菌体 5x107个/毫升
冰浴10分钟
含CaCl2缓冲液 15分钟 含CaCl2缓 冲液
（3）筛选转化子。
（2）DNA分子转化感受态细胞
菌间接合转移的有关基因
tra。
（Vir 区）
（Con区）
出毒性。占Ti质粒 1/3。
Ori区 ——复制起始区。
外源基因
Ti质粒载体
限制性酶 切开
（1）叶盘法转化植物细胞
（2）整体植株接种转化法
人为地在整体植株上造
成创伤部位，然后把农杆菌
接种在创伤表面，使农杆菌 按照天然的感染过程在植株
体内进行侵染。获得转化的
CHO，猴肾细胞等
• 受体动物：鼠、牛、羊、鱼等
第二节 重组基因导入受体细胞
一、重组基因导入原核受体细胞
接受DNA片段
（一）转化
1928年英国学者F·Griffth在肺炎双球菌中发现的，证
明了遗传的物质基础是DNA。
转化（transformation）——重组质粒DNA分子进入受体细胞，并在受 体细胞稳定维持和表达的过程，转化后的受 体菌，称转化子。 转化子 细胞数
（二）植物病毒介导基因转移 DNA病毒20%
植物病毒
RNA病毒80%
花椰菜花叶病毒：双链DNA病毒
（三）化学诱导DNA直接转化 （1）多聚物介导法 聚乙二醇 多聚赖氨酸 多聚鸟苷酸
（2）脂质体介导基因转化
脂质体
（四）物理方法介导DNA直接转化 （1）基因枪转化
（2）超声波介导转化 （3）激光微束穿孔转化
立的一种DNA转化方法。
二、重组基因导入植物受体细胞 （一）土壤农杆菌介导的Ti质粒转化 将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆 菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后
通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
外植体：植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段。 在继代培养时，将培养的组织切段移入新的培养基时，这 种切段也称外植体。
基因工程原理
Principle of Gene Engineering
第五章
第五章
基因工程原理
• DNA重组（限制性内切酶）
• 运输工具——基因克隆载体 • 目的基因的制备 • 目的基因导入受体细胞 • 外源基因的表达 • 基因工程的应用
第五章 重组基因导入受体细胞
第一节 受体细胞
受体细胞（receptor cell），又称宿主细胞或寄主细胞，是能
地高辛：异羟基洋地黄毒苷，强心素，拉诺辛，Cardiox，Cardoxin，Cedoxin
连接臂
地高辛
dUTP
（3） 萦光素标记探针：用萦光素标记核酸、抗生物素蛋白
或抗地高辛抗体。
萦光物质异硫氰酸萦光素（黄绿色）
罗丹明（红色）
羟基香豆素（兰色）
3. 标记探针的方法
（1） 切口平移标记法
（2） 随机引物标记法
（二） 免疫沉淀测定法（Immunoprecipitation, IP）
（三） 转译筛选法
五、PCR筛选法
一、遗传表型直接筛选
（一）利用载体选择性标记筛选转化子
1. 抗药性标记 氨苄青霉素 氯霉素 卡那霉素 四环素 链霉素
2. 插入失活筛选
3. 插入表达筛选
载体的选择性标记基因前链接一段附调控序列，插入式祸福调控序列后，其 下游的筛选标记基因才能表达
4. α－互补法（蓝白斑筛选法）
乳糖操纵子：
。
IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
α-互补：是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵
基因区段的 β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。
IPTG
IPTG：异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷
显色剂：X-gal，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，在β-半乳
分子杂交：生物大分子之间通过相互作用结合在一起：核酸之间通过碱基 互补配对；蛋白质之间通过抗原、抗体反应；核酸、蛋白质之间通过疏水
作用，氢键进行相互作用。
常见的分子杂交：
待测分子 探针
Southern blotting： DNA，
Northern blotting： RNA，
DNA/RNA
DNA/RNA
（二）转导
是指通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞将外源DNA
分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。
E突变
D突变
诱导溶菌生长 溶源菌培养 39℃ 45℃ 2-3h 15min
λ噬菌体DNA
噬菌体颗粒转导
（三）转染
是采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，将重组λ
噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程。
RNA分子和蛋白质。
1. 放射性探针：32P、3H、35S、14C、125I
2. 非放射性探针
（1） 生物素（biotin）标记探针：生物素与dUTP中尿嘧啶的5位C相连，在 聚合酶作用参入DNA
连接臂
Biotin (维生素H， VH)
dUTP
（藻红素 ） （链霉亲和素 ） （生物素 ）
（2） 地高辛标记探针：地高辛与UTP中尿嘧啶的C5相连
（3） 末端标记法
（4） PCR标记法
（5） 光敏标记法：
光敏基团
（6） 化学衍生结合标记法：
（7）交叉相连标记法：
1.
对重组体克隆进行筛选和鉴定的方法之一是利用核酸杂交法进行筛选， 它包括Southern印记杂交法、Northern印记杂交、斑点印记杂交和（菌落
原位杂交）杂交。
2. 各种杂交中需要对探针进行标记，其中对探针进行非放射性标记的常见 标记物有（荧光素）、（生物素）、（地高辛）。
5.
α-互补筛选属于下列哪种筛选方法：(B) C.原位杂交法
（1）胸苷激酶（TK）基因： 胸苷（T）转换成TMP的基因 （2）二氢叶酸还原酶（DHFR）基因 催化二氢叶酸还原成四氢叶酸
（3）黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（ XGPRT）基因：
催化GMP生成
（四） 营养缺陷型检测法
（五） 形成噬菌斑筛选法
二、依赖于重组子结构特征分析筛选
（一） 快速裂解菌落鉴定分子大小：琼脂糖电泳，分析 DNA分子大小
（二） 利用报告基因筛选植物转化细胞
（三） 利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞
（四） 营养缺陷型检测法
（五） 形成噬菌斑筛选法
二、依赖于重组子结构特征分析筛选
三、核酸杂交分析
（一）分子探针：放射性探针、非放射性探针、标记探针的方法 （二）核酸探针杂交分析 四、免疫化学分析检测 （一） 抗体检测法
③ 基因组简单，不含线粒体、质体
④ 多为单细胞，容易获得一致性材料，易于扩大培 养或发酵生长
常用细菌：大肠杆菌。
大肠杆菌。
• 特点：G-,单个细胞，0.5 μm * (1~3) μm，周身鞭毛、 能运动、无芽孢 。 • 例：胰岛素、生长素、干扰素、RE……
•
•
优点：完善成熟的受体系统。
缺点：毒素等，折叠加工问题
3.
标记探针的方法（切口平移标记法）、（随机引物标记法）、（末端标
记法）、（PCR标记法）、（光敏标记法）、化学衍生结合标记法以及 交叉相连标记法。
4.
在利用lacZ失活的显色反应筛选法中，IPTG的作用是( a )
(a)诱导宿主的α肽的合成 (c)作为酶的作用底物 (b)诱导宿主的ω肽的合成
(d)作为显色反应的指示剂
够摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。受体细胞的选择应 符合以下原则：
①便于重组DNA分子的导入
②能使重组DNA分子稳定存在于细胞中
③便于重组体的筛选 ④遗传稳定性高
⑤安全性高
⑥内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低 ⑦遗传密码无明显偏倚性
⑧具有较好的转移后加工机制
1.原核受体细胞
较为理想的受体细胞： ① ② 大部分没有细胞壁，便于外源DNA进入 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质
糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。
（二） 利用报告基因筛选植物转化细胞
报告基因 (reporter gene)——是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也
就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基 因表达调节序列相融合形成嵌合基标定目的基因的表达调控， 筛选得到转化体。 （1）新霉素磷酸转移酶（NPT Ⅱ）基因
目的基因，又称为阳性克隆子或期望重组子。
克隆子的筛选：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞 后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选
（Screening）或选择(Selection)。
一、遗传表型直接筛选 （一）利用载体选择性标记筛选转化子 1. 2. 3. 4. 抗药性标 插入失活筛选 插入表达筛选 α－互补法（蓝白斑筛选法）
• •
长度25kb，占Ti质粒1/10 主要功能是转移DNA，随机插入植物染色体中。 ——天然的质粒克隆载体。
•
含有2类基因：
（1）编码冠瘿碱合成酶（ocs、nos）及分解代谢的基因。 （2）诱发肿瘤基因（Onc）
Con区——调控Ti质粒在农杆 菌之间的转移，含有与细
Vir区：激活T-DNA 转移，使农杆菌表现
（4）显微注射
三、重组基因导入动物受体细胞
（一）转染法
（二）脂质体介导转化
（三）动物病毒介导转导法
第三节 重组子筛选
只有少数受体细胞能被导入重组DNA分子 例：大肠杆菌 108个大肠杆菌，转化效率10-6 只有100个细胞被转化