• 顺序： 二甲苯→1/2 二甲苯+1/2纯酒精→100%酒精→95 ％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→30％ 酒精→水→染色 以上各级约需5～10分钟。
9. 染色
• 染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的 颜色和足够强的差异以便于观察。 • 经染色可显示细胞内不同的细胞器及内含物以及不 同类型的细胞组织。 • 根据观察要求及研究内容采明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。
• 通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等 量混合液浸渍1～2小时或者过夜，再先后移入熔化 的石蜡液中浸渍几天。 • 浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以 利石蜡浸入组织内。
• 石蜡熔点：
45-50℃ 软蜡
55-60℃ 硬蜡
• 30%--50%---70%---85%---95%--100%--- 100% 每步 30-60分钟左右。
要求及注意事项
• 保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净。
• 不同大小的组织块脱水时间不同。
• 不能过度脱水（过久使组织变脆、收缩）
• 在50%酒精中加入曙红，用于染色。 • 材料可以放在70％酒精中保存。 • 正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。
2. 杀死与固定
目的---杀死各种酶，保持细胞的结构
固定液 固定时间 固定后的处理
最常用的固定液为FAA。固定时间不受限制，短则
数小时，长可延至数月或数年。
配方： 50％或70％酒精 90毫升 冰醋酸 5毫升 福尔马林 5毫升 柔软材料用50％酒精，坚硬材料用70％酒精配制。
• 卡诺氏(Carnoy’s)固定液：有极强的渗透力
组织固定后的处理
①冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，除去留在组 织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染 色效果。 ②材料经过固定后，需要保存下来以备利用，通常使 用的保存剂是70%的酒精溶液，可以使一般的材料 保存较长的时间而不至于变坏。 ③通常在冰箱中4℃存放。
3. 脱水
• 水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让透 明剂进入。 • 凡用酒精配制的固定液，一律用同浓度的酒清洗。 • 酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透 明剂相混。为了避免组织材料的急剧收缩，应按从 低浓度到高浓度递增的顺序进行.
石蜡制片的基本步骤 1.取材 2.杀死与固定 3.脱水 4.透明 5.浸蜡与包埋 6.切片 7.粘片与烤片 8.脱蜡与复水 9.染色 10.切片脱水、透明和封固
1.取材 1.1 材料来源及部位。 ①种类
②部位
③发育阶段
④是观察横切面还是纵切面？
1.2 取材原则： 动作：快，轻，用力均匀 体积合适 刀要锋利
甲液：明胶
甘油 苯酚 乙液：甲醛 蒸馏水
1克
15毫升 2克 4毫升 100毫升
蒸馏水 100毫升
8. 脱蜡及复水
干燥后的切片需脱蜡及复水才能在水溶性染
液中进行染色。 用二甲苯脱蜡，再逐级经梯度酒精复水。
• 脱蜡（溶蜡）：将切片上的石蜡溶去。一般都用二 甲苯溶脱蜡。如果脱蜡不彻底，材料的染色就困难。 • 复水：脱蜡后的材料从高浓度的酒精溶液（ 100%） 开始，逐级进入低浓度的酒精溶液，最后一级通常 是30%酒精或水，使材料中的水分逐渐增加。如果 不经过复水，材料脱蜡后直接进入染色剂中，材料 将会严重变形，甚至难以染色。
实验九
石蜡切片制作
一、实验目的与要求： 掌握石蜡切片制作的基本过程及其注意事项。
二、实验材料和仪器： 实验材料: 向日葵幼茎、石蜡、酒精、二甲苯、番红/固 绿染色液等；实验仪器和器皿：石蜡切片机、展片机、染色 缸、载玻片、盖玻片等。 三、实验内容与方法： 1.观看石蜡切片切片制作录像。 2.制作向日葵幼茎石蜡切片。 四、作业： 提交制作合格的向日葵幼茎石蜡切片。
• 固定根尖和花药只需40-60分钟，时间太长不好(不 能超一天)。
• 固定后用95％酒精冲洗，在组织不能立即处理时， 需转入70％酒精中保存。配法有两种：
固定组织时应注意：
①保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。
②组织块不易过大过厚，厚度必须控制在0.3cm以内。
③固定液必须有足够的量，一般大于组织20倍以上。 ④抽气：使固定液尽快渗入材料内部，并排除材料内 气泡的干扰。
4.透明
• 纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡 相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在 这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透 明剂，透明剂浸渍过程称透明。
• 常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等， 各种透明剂均是石蜡的溶剂。
• 通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1～ 2小时，再转入纯透明剂中浸渍。 • 材料进入无水的透明剂中后，若透明剂变浑浊，说 明材料中的水分未脱干净，必须回到前面一级无水 的脱水剂中再次脱水（但是效果往往不好）。 • 透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及组织 特性而定。
• 通常切片厚度为8～12微米，切出一片接一片的蜡 带，用毛笔轻托轻放在纸上。
7. 粘片与烤片
• 用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在 以后操作中材料脱落。
• 在载玻片上涂抹粘片剂，再滴蒸馏水，放上蜡片， 至于展片台上铺展，最后用滤纸吸除多余水分， 将载玻片放入42℃温箱中干燥。
常用的粘片剂为郝伯特(Haupt) 粘贴剂：
材料较硬的，用熔点较高的石蜡包埋； 切片较薄时（在8微米以下），用熔点较高的石蜡 包埋； 夏季采用熔点较高的石蜡（56,58）,冬季宜选用 熔点较低的石蜡（52,54）。
• 石蜡的处理：
新蜡应溶一次，增加密度。
并用滤纸过滤去除杂质。
加5%～10%的蜂蜡,增加石蜡的韧性。
反复溶的旧蜡包埋效果更好。
• 程序：在溶蜡箱中进行，55-60℃，恒温。
• 浸蜡：二甲苯透明后的组织块在二甲苯︰石蜡（1 ︰ 1）中1次，在石蜡中2次，每次1-3天左右。
• 包埋：在室温进行
6. 切片
• 包埋好的蜡块用刀片修 成规整的梯形，粘于小 木块上。
• 切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切 片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬 度。