蚌埠学院
生物与食品工程系
综合实验
实验名称：茶多酚的提取工艺试验
一、实验目的及要求：
1.了解茶多酚的性质和用途。
2.了解植物天然产物的常规提取及精制方法。
3.通过本实验的具体操作，掌握并熟悉茶多酚的提取与精制的方法及其操作原理和步骤。
4.掌握提取精制过程中茶多酚的分析检测方法。
二、实验原理：
茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称，含量约占茶叶干重量的20％－30％。
茶多酚可以消除超氧阴离子和过氧化氢自由基，同时具有抑菌、杀菌，有效降低大肠对胆固醇的吸收，增强机体免疫能力等功能。
目前，茶多酚被广泛的用作食品、饮料、药品和化妆品的天然添加成分。
（离子沉淀法）茶多酚易溶于热水，与一些金属离子形成络合物，并在一定pH值下溶解度很低。
形成的金属离子络合物溶于酸溶液后，茶多酚再次转变成游离状态，再用对茶多酚有更好选择性的溶剂进行萃取、浓缩和干燥，即可得到茶多酚的纯品。
三、实验仪器：
电动搅拌器、离心机、pH试纸、真空干燥箱、抽虑瓶、旋转蒸发仪、真空泵、天平、紫外分光光度计、容量瓶、烧杯、量筒等。
四、实验试剂及材料：
氯化钠、碳酸氢钠、柠檬酸、硫酸铝、盐酸、亚硫酸氢钠、乙酸乙酯、维生素C（抗坏血酸）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、酒石酸钾钠、硫酸、绿茶等
五、实验内容及步骤：
1．浸提
1.1 预处理:粉碎干茶叶;粉碎的目的是与液体的接触面增大,使提取率增高；
1.2 提取:准确称取经过预处理的干茶叶末10. 00g,按照单因素实验的料液比、浸提温度、浸提时间分别搅拌浸提。
过滤（用抽滤的方法）得到茶多酚提取液。
用附一的方法测提取液中的茶多酚含量。
单因素实验步骤：
（1）将称取得10.00g茶叶末置于500ml烧杯中，加入200mL蒸馏水，在85℃下，分别提取0.5h、0.75h、1.0h、1.25h、1.5h，测提取液的
吸光度，绘制曲线图，找出最佳提取时间。
（2）称取得10.00g茶叶末置于500ml烧杯中，加入200mL蒸馏水，在所测得的最佳提取时间下，分别在75℃、80℃、85℃、90℃、95℃下浸提，测提取液的吸光度，绘制曲线，找出最佳提取温度。
（3）在上述的最佳提取温度，最佳提取时间下，分别用1:10、1:15、1:20、1:25、1:30的料液比浸提，绘制提取液的吸光度曲线，找出最佳料液比。
单因素：
①料液比(g/L)：1:10 1:15 1:20 1:25 1:30
②浸提温度(℃)：75 80 85 90 95
③浸提时间(h)：0.5 0.75 1.0 1.25 1.5
取单因素实验的每个因素的最佳范围内的值，做三因素三水平的正交实验。
实验结果记录在附五的实验记录表格中。
通过对正交实验进行极差分析后选出最优组合，进行下一步实验。
2．盐析
加氯化钠于茶叶浸提液中，质量分数为2-6％，静置0.5-1.5h 后过滤（可用抽滤或者离心的方式）。
3.沉淀
在上述滤液中加入茶叶重量2％～5％的NaHSO3，然后加入茶叶重量20％的硫酸铝饱和水溶液，加热至70℃～80℃，用15%NaHCO3溶液在快速搅拌下调节pH至5～6，此时有大量沉淀析出，沉淀自然沉降一段时间后过滤，最后用等体积70℃热水洗涤沉淀三次。
4．酸溶
将沉淀在快速搅拌下放入到一定料酸比体积下的pH＝2.5~4.5的硫酸水溶液中溶解沉淀，控制酸转溶液的pH、酸溶时间，少量胶状沉淀经抽提去除。
用附一的方法测酸转溶液中茶多酚的含量
单因素实验步骤：
（1）将上一步骤所得的沉淀放入有40mL、pH=3.0的硫酸水溶的烧杯中，溶解，分别溶解40min、45min、50min、55min、60min，离心除去沉淀，测酸转溶液的吸光度，绘制曲线，找出最佳酸转时间。
（2）取上一步骤所得的沉淀放入有40mL硫酸水溶液的烧杯中，控制硫酸的pH为2.5、3.0、3.、4.0、4.5，在（1）的最佳酸转时间下，溶解，离心去除沉淀，测酸转溶液的吸光度，绘制曲线，找出最佳酸
转浓度。
（3）取沉淀置于有20mL、30mL、40mL、50mL、60mL硫酸水溶液的烧杯中，在上述的最佳酸转浓度、最佳酸转时间下，溶解，离心去除沉淀，测酸转溶液的吸光度，绘制曲线，找出最佳酸浓度。
单因素：
①酸浓度（pH）：2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
②料酸比（g/mL）：1:2 1:3 1:4 1:5 1:6
③酸转时间（min）：40 45 50 55 60
三因素（酸浓度；料酸比；酸转时间）
取单因素实验的每个因素的最佳范围内的值，做三因素三水平的正交实验。
实验结果记录在附六的实验记录表格中。
通过对正交实验进行极差分析后选出最优组合，进行下一步实验。
5．萃取
加入茶叶重量2％－5％的NaHSO3至酸转溶液中，然后用体积0.3-1.5倍的乙酸乙酯萃取1－5次，每次萃取时间2-10min，合并萃取液。
测萃余相体积，并取样分析计算萃余相中茶多酚的总量，计算茶多酚的萃取率。
6．洗涤
加入茶叶重量1-3％的维生素C至萃取液体积0.4倍的水中，用柠檬酸调节水溶液的pH=2.5-3.0，等分成2份对乙酸乙酯萃取液洗涤两次。
7．蒸发浓缩
将洗涤后的乙酸乙酯相在50～70℃下真空蒸发回收乙酸乙酯，待浓缩成膏状物时，加入膏状物2倍体积的无水乙醇洗涤挂在壁上的物料，继续浓缩成稠的膏状物。
计算其中茶多酚的含量。
六、实验注意事项：
1.茶多酚易氧化，分离过程中注意避免高温，过酸或过碱并尽量缩短提取时间。
2.沉淀完全后应尽快抽提滤出沉淀，酸溶过程一定要充分，控制好溶液pH。
七、思考题：
通过对本工艺的实验结果进行分析，讨论分析哪些因素影响茶多酚产品的产率？怎样影响的？应如何控制？
附一：提取过程中茶多酚的分析测定方法（定量）
准确吸取待测溶液1ml，将其稀释1～25倍（稀释成15倍），再从稀释液中准确吸取1ml，注入25ml的容量瓶中，加水4ml和酒石酸亚铁溶液5ml，充分混合，再加pH=7.5的磷酸盐缓冲溶液至刻度，用1cm比色杯，在波长540nm处，以试剂空白液作参比，测定吸光度。
计算公式：茶多酚（g/ml）=1.957AX/500
A:吸光度 X:稀释倍数。
1）酒石酸亚铁溶液
1g硫酸亚铁和5g酒石酸钾钠用水溶解并定容至至1L，放置过夜后使用。
2）pH=7.5的磷酸二氢钾缓冲液
A液：称取磷酸氢二纳23.877g,溶解并定容至至1L；
B液：称取经110度烘干2h的磷酸二氢钾9.078g，加水溶解并定容至至1L
A液85ml和B液15ml混匀即可。
附二：计算项目：
1)浸提液中茶多酚的总量及茶多酚的浸提率计算
浸提液中茶多酚的总量（g）=浸提液中茶多酚的含量（g/ml）×浸提液体积（ml）
茶多酚的浸提率=[浸提液中茶多酚的总量（g）／原料茶叶末中茶多酚的总量（g）]×100%
2)经过盐析、沉淀及酸溶后茶多酚的总量和回收率计算
酸转溶液中茶多酚的总量（g）=酸转溶液中茶多酚的含量（g/ml）×酸转溶液的体积（ml）
酸转溶液中茶多酚的回收率=[酸转溶液中茶多酚的总量（g）/浸提液中茶多酚的总量（g）]×100%
3)萃余相中茶多酚的总量和茶多酚的萃取率计算
萃余相中茶多酚的总量（g）=萃余相中茶多酚的含量（g/ml）×萃
余相溶液的体积（ml）
茶多酚的萃取率=100%×[酸转溶液中茶多酚的总量（g）-萃余相中茶多酚的总量（g）] /酸转溶液中茶多酚的总量（g）
4）茶多酚的最终得率计算
100%×[酸转溶液中茶多酚的总量（g）-萃余相中茶多酚的总量（g）]/原料茶叶的重量
附四：
浸提单因素实验记录表格：
酸转单因素实验记录表
附五：
浸提正交试验记录表格：
附六：
料液比g/ml 1:10 1:15 1:20 1:25 1:30 吸光度0.189 0.172 0.162 0.103 0.106 茶多酚含量(g) 0.222 0.303 0.38 0.302 0.373
浸提温度℃50 60 70 80 90 吸光度0.084 0.092 0.124 0.251 0.185
浸提时间min 20 30 40 50 60 吸光度0.098 0.118 0.181 0.185 0.184
酸浓度mol/L 2 3 4 5 6 吸光度0.13 0.141 0.147 0.137 0.122
料酸比g/mL 1:10 1:15 1:20 1:25 1:30 吸光度0.186 0.206 0.107 0.121 0.116 茶多酚含量(g) 0.0546 0.0819 0.063 0.089 0.102
酸转时间min 5 10 15 20 25 吸光度0.098 0.138 0.154 0.11 0.123
实验号 A B C D 茶多酚含量酸浓度料酸比酸转时间空列（g）
实验1 1 1 1 0.00657552 实验2 1 2 2 0.00146775 实验3 1 3 3 0.0070452 实验4 2 1 2 0.00504906 实验5 2 2 3 0.0017613 实验6 2 3 1 0.0105678 实验7 3 1 3 0.0017613 实验8 3 2 1 0.007485525 实验9 3 3 2 0.00598842 K10.005 0.004 0.008
K20.006 0.004 0.004
K30.005 0.008 0.004
R 0.001 0.004 0.004。