肿瘤干细胞研究的问题和进展谭亚军侯启明张庶民中国食品药品检定研究院，卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室摘要近年来，肿瘤干细胞理论研究得到迅猛发展，它为我们重新认识肿瘤的起源和本质提供了新的方向和视角，但同时也存在争议。

该文就肿瘤干细胞理论发展历程，目前该研究领域存在的一些问题，面临的挑战和最新研究进展作一综述。

关键词：肿瘤，肿瘤干细胞，肿瘤治疗从20世纪50年代至今，随着生物技术的发展，肿瘤干细胞(Cancer Stem Cell，CSC)学说经历了从设想到验证的漫长历程，它的提出为研究肿瘤细胞的生物学特性和肿瘤临床治疗提供了新的思路。

这一学说［1］认为，肿瘤组织中存在少量干细胞样的癌细胞亚群，具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能，能够分化为组成肿瘤的大部分细胞，并使肿瘤具有异质、增殖、浸润等特性，这一细胞亚群称之为肿瘤干细胞。

近年来，肿瘤干细胞理论得到越来越多研究者的重视和发展，但同时也伴随着一些争议。

最近的一些报道表明有些肿瘤中约十分之一甚至四分之一的肿瘤细胞都具有CSC的特性[2、3]，这更是与CSC是一少量细胞亚群的基本概念相矛盾。

很多人也因此对肿瘤干细胞假说产生了质疑。

伴随着科学技术手段的不断提高，相信我们能对肿瘤干细胞有更加全面的认识，这些质疑也将逐步揭开。

1. 肿瘤干细胞理论的发展历程干细胞的研究中，白血病干细胞的分离和表面标记测定开始得较早。

因此,肿瘤干细胞在造血系统中研究的最早也最深入。

早在1958年，Hewitt[4]将小鼠白血病细胞移植到同种小鼠体内后，发现仅有1%- 4%细胞能在小鼠脾脏内形成克隆集落，故认为只有部分肿瘤细胞具有致瘤性。

Park 等[5]从小鼠腹水中提取骨髓瘤细胞进行体外克隆培养，发现仅有0.01%-1% 细胞可以形成克隆集落。

1977年，Hamburger 和Salmon[6]发现只有0.02%- 0.1%的小细胞肺癌、卵巢腺癌、神经母细胞瘤、黑色素瘤等实体瘤细胞能够在特制的培养基上形成集落。

这些实验初步证明肿瘤组织中的大部分细胞可能来自其中一些具有干细胞性质的亚细胞群，即肿瘤干细胞，但由于技术手段的限制并未对这些细胞进行分离和鉴定。

自荧光技术的诞生到流式细胞术的运用，再到各种实验小鼠模型的建立，大大推进了细胞技术的发展。

与此同时，肿瘤干细胞理论也得到了迅猛的发展。

根据细胞表面上的标记抗原，利用荧光抗体技术及流式细胞技术，可以对血液系统和实体组织中多种类型的细胞进行鉴定与分析。

实验小鼠模型的建立对研究干细胞的自我更新和无限繁殖功能也具有重要意义。

为了满足对于肿瘤细胞连续的传代移植和白血病多亚型分析等研究，1992年，Prochazka 等[7]建立了非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficient and non-obese diabetic，NOD/SCID)小鼠模型。

John Dick 等随后利用这个模型对各类型的白血病进行大量研究，在1997年与Bonnet[8]首次确认了人类急性髓性白血病中肿瘤干细胞的存在,并成功分离出来。

研究发现大多数白血病细胞不能持续增殖，只有0.2%-1%的细胞亚群有持续的克隆形成能力,与造血干细胞有相似的表型,即CD34+ CD38-Thy-1-细胞，这种细胞移植到NOD/SCID小鼠后能形成类似白血病的肿瘤细胞。

至此，白血病干细胞的存在得到公认。

随后，根据细胞表面的某些特异标记，陆续鉴定出一些实体瘤的干细胞样细胞。

2003年Al-Hajj 等[9]首次从乳腺癌组织中分离出细胞表面标志为CD44+CD24-/low Lineage-的致瘤性癌细胞，这些细胞具有肿瘤干细胞样特性。

研究表明，提取200个表型为CD44+CD24-/low Lineage-的细胞，植入NOD/SCID小鼠体内，约12 周出现明显肿瘤；而未分离的癌细胞需5 × 104个才能形成肿瘤。

这种致瘤性的细胞亚群在NOD/SCID小鼠中可持续地形成肿瘤，产生的新肿瘤中不仅包含有致瘤型细胞和原发肿瘤中其他的非致瘤型细胞，与正常干细胞自我更新和分化的特征相似。

虽然这种细胞在数量上仅占整个乳腺肿瘤细胞的2%，但是其重建肿瘤的能力却是其他表型肿瘤细胞的50倍。

Singh等[10]从人脑瘤中分离出CD133+和CD133-脑瘤细胞，只有CD133 +的肿瘤细胞才能在体外培养中形成肿瘤球,具有较强的自我更新能力及增殖致瘤能力,仅需100个细胞就可以使NOD/SCID小鼠形成新的肿瘤，并能连续传代致瘤。

而CD133-的肿瘤细胞数量虽占多数，却不能使小鼠形成肿瘤。

此后，又有室管膜、前列腺、胰腺、肺腺、甲状腺、皮肤、结肠、直肠等部位的CSC被陆续分离出来[11-18]，使CSC学说得到了进一步的实验支持。

2. 目前肿瘤干细胞研究存在的问题2.1 肿瘤干细胞的分离直到今天，肿瘤干细胞的鉴定、分离和培养仍然是肿瘤干细胞研究的一大瓶颈。

目前分离CSC的方法主要有利用肿瘤干细胞细胞表面标志物，采用荧光活化细胞分选系统( FACS)及磁性活化细胞分选系统(MACS)，以及根据其生物学特性采用旁路细胞分选法进行功能分选两大类，但他们都有自身局限性。

目前对肿瘤干细胞标志物的研究多沿用干细胞的研究，干细胞的严格鉴定和分离也仅在极少的组织中完成，许多实体组织自身的干细胞表面标志物尚未确定，因此对CSC的表型分离鉴定还仅限于少数实体肿瘤。

研究发现肿瘤细胞具有某些相同的表面分子标记[19、20]：如表达CD133、CD44、CD34及CD38等等，其中CD133标记分子在目前CSC研究中应用较多。

但这些表面标记分子很难区分正常组织干细胞和CSC。

这方面的研究进展还只是起步阶段。

因此，通过CSC的细胞特异表面标记物来鉴定分选的难题就在于表面标记物的确定。

另外荧光激活细胞分选术分选的CSC不能分选出单个细胞而使分选出的CSC中可能混有其它癌细胞，磁性激活细胞分选术可能会影响到细胞的活性。

旁群细胞分选法是根据CSC的SP (Side Population, SP)细胞特性进行分选。

CSC具有SP细胞特性，能将荧光染料Hoechst 33342 排除体外而在流式细胞检测中表现为不着色。

虽然这种方法方便、经济，还有利于分离纯化未知表面标志物的肿瘤干细胞[21]，但由于染料Hoechst 33342 鉴定分选出的SP细胞并不全都是CSC，这就对鉴定出来的CSC纯度提出了要求[22]。

2.2 肿瘤干细胞的鉴定肿瘤干细胞的鉴定，需要通过实验来证明该群细胞具有自我更新及产生异质性细胞群体的潜能，即能自我克隆产生致瘤性肿瘤细胞，同时又能分化出不同表型的非致瘤性肿瘤细胞，而且最重要的功能特征是能导致肿瘤的形成。

目前针对肿瘤干细胞检测的一个普遍的方法是异种异体移植实验(xenotransplantation)，即具有免疫缺陷的NOD/SCID 鼠成瘤性测试。

利用分离技术获得表型不同的细胞群，将其植入NOD/SCID 小鼠体内，若是CSC会有强致瘤性，仅需少量细胞即可致瘤，而且形成的移植瘤与原发肿瘤高度相似。

另外包括体外实验，大都采用添加一些生长因子的无血清培养基培养，通过集落形成实验、细胞周期、基因和表型测定及体外诱导分化等，测定其生物学特性。

只有通过以上检测所证明的具有自我更新潜能的强致瘤性细胞，才能确定为肿瘤干细胞。

但这一实验方法近年来受到一些学者的质疑。

来自澳大利亚墨尔本大学的Strasser小组认为异体移植实验掩盖了微环境对肿瘤细胞的影响，由于人与鼠体内的微环境的不同，不能够说明在鼠体内有致瘤性的那些来自人的癌细胞即为肿瘤干细胞[2、23]。

他们认为人的肿瘤细胞之所以能够在鼠体内存活并成瘤，可能是由于这些细胞得到了某些特性从而能够适应新的环境，而非这些细胞是具有自我更新功能的癌干细胞。

由于肿瘤干细胞的分离鉴定方法还不完善以及人为因素的干扰都为肿瘤干细胞的分离纯化提出了更高的要求。

肿瘤细胞的体外研究忽略了组织周围环境对细胞的影响，而分离也对组织造成损伤，使癌细胞间失去了原有的联系，对后续研究都有影响。

2.3 肿瘤干细胞学说的质疑2001 年，Reya 等[1]在《Nature》上发表文章提出当代肿瘤干细胞学说，认为肿瘤组织存在一小部分具有干细胞性质的肿瘤干细胞，其具有无限的自我更新、多向分化潜能与高度增殖能力，能够产生不同表型的肿瘤细胞，并赋予肿瘤异质、增殖、浸润等特性。

以往研究也表明肿瘤干细胞是一类含量很少的致瘤性细胞亚群(<0.1%)[3]。

但近来，Kelly[2]、Quintana[3]和我国学者先后发表的研究结果向这一概念提出了挑战。

2007年，通过实验Kelly 等[2]质疑CSC的概念。

为排除异种异体移植的复杂性, 他们进行了同种异体移植实验，从三种转基因小鼠中分离出淋巴瘤细胞，以10－105个的细胞数量分别注入组织相容性受体小鼠体内，结果表明10个淋巴瘤细胞即可在受体小鼠内成瘤，只不过比注入105个细胞需要的成瘤时间要长。

他们建议这类细胞应被称为“肿瘤传播细胞”，并指出人和小鼠细胞因子受体不相容导致了以往实验结果的偏差。

A dams 等[24] 对此作出回应，进一步分析了人和小鼠白血病及淋巴瘤实验，认为现在的异种移植系统可能低估了能维持人类肿瘤生长的细胞比例。

他们否定肿瘤干细胞学说，认为肿瘤的发生不受所谓的极少量的CSC 的驱动，而是取决于肿瘤细胞与其周围微环境的适应能力，之所以在肿瘤移植中只有极少一部分具有致瘤性是因为移植的肿瘤细胞只有极少量能适应移植到的微环境而稳定地生长，其他没有表达出致瘤性只是因为它们不适应相关的微环境罢了，而不是因为它们本身没有致瘤性。

他们的观点牵涉到传统的克隆演变学说，直接冲击了肿瘤干细胞学说的基础概念[1]。

不久后Kennedy 等[25]针对Kelly 等的观点进行了反驳，他们认为，白血病细胞通过同种或异种移植到小鼠体内，不同肿瘤中白血病起源细胞(1eukemia-initiating cell, L-IC)存在的差异性(0.001％至1％)可能是由于不同肿瘤组织所含的CSC比例不同所造成的。

2008年，Quintana 等[3]利用NOD/SCID IL2Rγinterleukin-2 receptor gamma chain null (IL2rg-/-)受体小鼠等手段优化了异种异体移植系统，并利用有限稀释和单细胞移植等方法对人黑色素瘤细胞进行了致瘤性分析，结果表明27%的黑素瘤细胞可在小鼠体内形成肿瘤。

最近，我国学者报道B16-F10黑色素瘤细胞在同基因小鼠间移植，有相当高比例（>10%）的细胞具有致瘤性[26]。

以上研究表明肿瘤组织中的大部分细胞均具有致瘤性，虽然这与肿瘤干细胞理论所描述的肿瘤组织中只有一小部分癌干细胞作为肿瘤源泉的说法相悖，但这将有助于我们更加全面认识肿瘤干细胞假说，肿瘤干细胞的产生和肿瘤形成可能是存在多种不同机制，不可能用一种模式来解释。