（3）、待检病毒核酸的扩增与标记
提取病毒RNA后,用锚定随机引物进行反转录获得cDNA 作模板,反转录随机引物序列为5′-GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNNNNN-3′,然后用测序酶合成第二链cDNA,随机PCR 扩增用随机引物5′-GTTTCCCAGT-CAOGATC-3′进行,并在 扩增的过程中掺入aa-dUTP对PCR产物进行标记,PCR反应 体系为100ug,扩增条件为95℃变性5min,然后94℃30s、 55℃30s、72℃60s,共35个循环。
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图1、利用基因芯片进行杂交测序 的原理
三、基因芯片的技术流程
三、基因芯片的技术流程
T7 promoter
PCR
体内转录
T7 promoter
荧光素
片段化
1.5 小时
杂交、冲洗
ACGT
扫描分析 1 小时
图 2 样品处理与检测过程简图
四、基因芯片技术与传统杂交 检测方式的比较
操作 自动化程度 一次可检测的序列个数 总体效率 基因芯片技术 传统杂交方法 简便 很高 复杂 很低 极大 很小 很高 很低
二、基因芯片的基本原理
基因芯片的制作技术主要包括芯片制备，样品制备， 杂交反应，信号检测和结果分析。
将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品 DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针，然后再与芯片上 寡核苷酸点杂交，最后通过扫描仪定量好分析荧光分 布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。
该技术可检测各种介质中的微生物，研究复杂微 生物群体的基因表达。
（2）、病毒的培养和病毒核酸的提取
EEEV、WEEV、VEEV、MAYV、WNV和JBEV用BHK细胞培养,1-4型 DENV用C6/36细胞培养,BUNV用Vero-E6细胞培养。产生细胞病变 后,将培养瓶在-70℃冰箱中冻融,用于病毒核酸的提取。 由于以上13种虫媒病毒均为RNA病毒,因此,病毒总RNA用 QIAGENRNAeasy试剂盒提取。
(二)、杨银辉等利用实验室建立的医学病毒属
水平筛查基因芯片及主要虫媒病毒检测基因芯片， 对２００６年７月从山西临沂地区猪脑组织中分 离到的未知病毒进行筛查与鉴定，初步筛查显示 该病原体属于黄病毒属，结合流行病学调查分析， 进一步与主要虫媒病毒检测基因芯片杂交，判断 该病原体为乙型脑炎病毒，与 ＰＣＲ及基因序 列检测结果一致.
基因芯片技术
一、基因芯片的基本概念及发展经过
基因芯片(Gene chip) 又称DNA 芯片（ DNA Chip ）或生物芯片 (Biological chip), 它是指将大量探针分子固定于支持物上，然 后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强 度及分布进而对靶分子的序列和数量进行分析。
通俗地说，就是通过微加工技术 ，将数以万计、 乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针）， 有规律地排列固定于2cm2 的硅片、玻片 等支持物 上，构成的一个二维DNA探针阵列，与计算机的电 子芯片十分相似，所以被称为基因芯片。
DNA 样 品 TATGCAATCTAG 与基因芯片上 65,000 种可能的 八聚体进行杂交从而形成特定 的结合图形 1 ATACGTTA CGTTAGAT 22 GTTAGATC
4 CGTTAGAT 4 ACGTTAGA 33 TACGTTAG ACGTTAGA 5 GTTAGATC 1 ATACGTTA 3 4 2 5 TACGTTAG ACGTTAGA CGTTAGAT GTTAGATC 计算机分析杂交图象 并由探针的重叠情况 推导样品的核酸序列 互补序列为：ATACGTTAGATC 样品序列为：TATGCAATCTAG
扩增产物用Amicon Microcon-PCR纯化柱进行纯化,与 lmol/L碳酸氢钠混合,然后将待检病毒及细胞基因组的 PCR产物分别与cyTM3和CyTM5偶联,经纯化后可用于芯片 杂交。
（4）、基因芯片的制备
使用醛基化处理的玻片,纯化干燥后的寡核昔酸探针用 3X标准柠檬酸盐溶液溶解,使终浓度为40umol/L。用Spot Array72进行点样,每条探针重复点样3次,每种样品点成 4×4的矩阵,每种病毒的10个探针分散点样在4个矩阵中。 点样后的芯片用HoeferLJVC500紫外交联仪以 600×100uJ/cm2交联2次,用于芯片的杂交。 （5）、芯片杂交反应 将芯片在含甲酞胺的杂交液中于42℃预杂交1h,同时将 标记好并纯化的待检病毒靶核酸溶于含酵母tRNA、Poly-A、 SSC及SDS的杂交液中,于99℃变性2-5min后加入甲酞胺,滴 加到芯片上,盖上盖玻片后进行杂交,42℃水浴孵育8-16h。 杂交结束后分别在2xSSC、0.2xSSC蒸馏水和无水乙醇中进 行洗涤。
｛
优点：合成效率高、点阵密度高 缺点：设备昂贵、技术复杂、反映产率低
“点膜”型：合成工作用传统的DNA固相合成仪式完成，只是 合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂 布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻璃片上。
｛优点：设备廉价、技术简便、研制周期短、灵活度高 缺点：点阵密度低
七、基因芯片技术的应用
（6）、结果判断 基因芯片杂交结果用ScanArray Gx Plus扫描仪 进行扫描,用GenePixPro5.1软件进行分析。在所有 的检测中,病毒感染的细胞上清用一种荧光染料标 记,而阴性对照的未感染病毒的细胞上清用另一种 荧光染料标记。 取病毒荧光信号绝对值大于1000或与细胞荧光信 号强度比值在2.0以上的点为阳性信号点。
五、基因芯片的基本构造
探针 支持物
外观
剖面图
平面局部放大
1.支持物：如玻片、硅片、NC膜、Nylon膜 2.探针：高密度的探针序列按照一定的次序固定 在支持物上，每个位点的序列是已知的
六、基因芯片的主要类型
从点阵的制备方法分
原位合成型
“点膜”型
原位合成型：根据预先设计的点阵序列在每个位点通过有机 合成的方式直接聚合得到所要求的探针分子
（一）、朱晓光、杨银辉、康晓平等人写了13种虫媒病毒基 因芯片检测方法的建立等论文 1、方法
（1）寡核昔酸探针的设计与合成寡核昔酸探针 由华大基因公司设计并合成。每条探针长度为70mer,mT介于 75一85℃。每种病毒设计5条寡核昔酸探针及相同数量的互补 序列探针,用于病毒特异性鉴定。另外,针对以上13种病毒所 在的3个病毒属,各设计10条寡核昔酸探针,探针总数为160条, 用于属水平的筛查。