SERS spectra of single E. coli DH5a cells with different levels of 15N incorporation when growing in various concentrations of 15N-NH4Cl. The detection limit is 10% 15N incorporation (P < 0.05). (a) A sharp and clear Raman band at 728 cm-1 (adenine-like compound) shifted due to 15N incorporation into cellular biomass. (b) Relationship between the 15N ratio in single cells and Raman shift.
技术指标
分辨率
人眼：0.2mm；光学显微镜：0.25m；电子显微镜： 0.2nm；共聚焦显微镜：0.18 m。 较之传统显微镜 1）抑制图像的模糊，成像更清楚； 2）具有更高的轴向分辨率，可连续层相成像； 3）增加侧向分辨率。
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d confocal
d conventional 2 自发拉曼光谱的主要不足是信号太 弱，若一味提高激发光的强度，可能会损 伤细胞，同时采样时间太长也不利于动态 过程的测定，目前提高信噪比的两种基本 办法是：表面增强拉曼散射和相干反斯托 克斯光谱两种分析策略。
1）表面增强拉拉曼光谱
将样品与胶质金属颗粒如银、金或铜混合， 或吸附在这些金属片的粗糙表面上吗，发现光 谱的强度可提高 103-106 倍。一般认为具有一定 表面粗糙度的类自由电子金属基底的存在，使 得入射光在表面局域的电磁场得到加强，而拉 曼散射强度与分子诱导极化化率平方成正比， 因此极大地增强了表面吸附分子的拉曼效应。
2）共振反斯托克斯拉曼光谱
该过程是一种三阶非线性光学过程，通常采 用两束中心频率不同的激光脉冲，分别作为抽运 光（ L ）和斯托克斯光（ S ）来激发样品分子， 当两束激光的频率差与分子某一振动模式的固有 振动频率一致时（R=L-S）， 分子的固有振动 模式得到共振增强，并在第三束探测光（ P ）的 作用下产生反斯托克斯信号（AS）， 其能级图如 图所示，分为两步，第一步，抽运光和斯托克斯 光脉冲同时到达样品使分子共振激发，在湮没一 个抽运光光子的同时产生一个斯托克斯光子和一 个相干声子；第二步 , 产生的相干声子随后与探 测光光子作用, 反射反斯托克斯光子。
1.激光共聚焦显微成像技术
以激光作为光源，激光器发出的激光通过 照明针孔形成点光源， 经过透镜、分光镜形成 平行光后，再由物透镜聚焦在样品上，对样品 内聚焦平面上的每一点进行扫描，样品激发的 光信号，通过分光镜分光，再经像透镜聚焦， 到达探测针孔处，被后续的光电倍增管检测， 并在显示器上成像，得到所需的荧光图像，而 非聚焦光线被探测针孔光栏所阻挡，因而不能 不能被检测。这种双共轭成像方式称为共聚焦。
自发拉曼光谱
入射光被其诱导的分子极化场所散射而频率发生变 化的光谱，在每条入射光频率 V0 的两侧对称地分布着频 率为 V0Vi 的谱线，其中 V 相应于分子的某一振动跃迁 频率，长波一侧的谱线称为红伴线或斯托克斯线，短波 一侧的谱线称为紫伴线或反斯托克斯线。
谱线特征 1）与入射光的频率无关，而由散射物质分子的 振（转）能级所决定，因此有些谱线是与红外 吸收谱线相一致。 2）在以波数为变量的拉曼光谱图上，斯托克斯 线和反斯托克斯线对称地分布在瑞利散射线两 侧，上述两种情况下分别相应于得到或失去了 一个分子声子的振动能量。 3）一般情况下，斯托克斯线比反斯托克斯线的 强度大，因为依据 Boltzmann分布，处于振动基 态上的粒子数远大于处于振动激发态上的粒子 数。
共振反斯托克斯拉曼光谱显著地提高了信号强度，同时由于 信号相对蓝移，可以很好的与激发光分开，而过程存在的固 有非共振背景噪声，可以利于两者的偏振状态、退相时间， 以及空间域的差异进行相应抑制。
3.同位素探针-拉曼光谱
同位素探针是指通过底物完成对生物标志 物的标记，带有重同位素的生物标志物，其拉 曼特征谱线因同位效应将发生红移动，采用光 谱对比分析很容易鉴别出来，进而确定标志物， 并与系统生物功能成分相联系，甚至由标记结 合率确定新合成生物的比例及其动态过程。 理论解释 拉曼谱是入射光与分子相互作用，诱导其 共价键的电子云形变产生极化场，进而相干叠 加而形成散射光，散射光频率相对于入射光丢 失和增加一个相应分子键的振动频率。按照经 典的分子键的谐振子模型，
分子键的振动频率可以表示为
1 k/ 2c
此处，c为光速(ms-1),k为双原子键的作用常数 （Nm-1）,是体系的约化质量， =m1m2/(m1+m2), 可见振动频率反比于约化质量的平方根，当原 子被其重同位素原子取代后，约化质量增加， 而振动频率减小，因此特征谱线发生红移，以 C-H键的氘代为例，C-D的频率相对变化为0.73， 漂移带的相对强度则与重同位素的结合率成正 比，依此可以计算底物的结合率。
基本原理
利用放置在光源后的照 明针孔(P1)和放置在检测器 前的探测针孔(P2)实现点照 明和点探测，激光经过照明 针孔形成点光源，由物镜聚 焦在样品焦面的某个物点上， 只有该点所发射的荧光成像 在探测针孔上，该点以外的 任何位置发射光线被探测器 阻挡，不能到达 PMT 探测器， 从而提高了成像效果。照明 针孔和探测针孔共轭聚焦， 所有被探测点均在物平面为 共焦的平面。
单细胞同位素拉曼散射分析
中国农业大学 齐孟文
• 前言
细胞是生物体结构和功能的基本单位，环 境生态中的所有物质转化和生命活动现象，只 有基于细胞的分析才能得到本质上的阐述，而 细胞的生命驱动力是细胞代谢，解析细胞代谢 的过程，展现其瞬时动态图像，是一切生物转 化相关过程研究在方法学上必须最终解决的问 题，其关系到生态学，环境学，生物学，生物 医学等众多相关领域，具有重大意义。
分析特征
1）利用待测样品分子的特征拉曼谱线作为检测 或灰度对比度成像，无需引入外源标记物（同 位素由底物引入，认为是内原的），因此是非 侵入式的测量； 2）水的拉曼背景信号较小，因此可在水环境下 测量； 3）一般采用近红外光激发，对细胞组织的光损 伤较小，能够穿透较厚的生物样品，有利于长 时间采集样本和进行样品内部测量； 4）不利因素是自发斯托克斯的信号较弱，只有 106-108个光子，影响探测灵敏度的提高。
Tef.single cell stable isotope probing in microbiology using Raman microspectroscopy Yun Wang1, Wei E Huang2, Li Cui3 and Michael Wagner. Available online at
4.单细胞同位素拉曼谱的应用
单细胞同位素拉曼分析一种具有高通 量、非破坏，细胞全化学谱系的（包括蛋 白质，核酸，碳水化合物，脂类 和色素 等细胞储藏分子），非细胞培养的，单细 胞水平上的分析方法，可用于细胞代谢、 细胞活性分类、及储藏物质周转等生态学 和生物学研究。
一般分析线路
Overview of the single cell bio-analysis technology. Single cell bio-analysis can be generally classified as indirect or direct measurements. A typical indirect measurement is fluorescence based which is sensitive but requires external labelling. Single cell Raman spectroscopy (SCRS) is a noninvasive and labelfree technology. SCRS detects biomolecule vibrations from a single cell which serves as a cellular intrinsic ‘fingerprint’ that reflects the cell phenotype and physiological state. Raman-FISH is a combination of fluorescence and Raman technology . Raman imaging and mapping produce Raman pseudo-colour images according to the intensities of Raman spectral bands. The Raman imaging distinguishes the actively CO2 fixing cells (red) and the inert cells (green) . Raman activated cell sorting (RACS) is able to separate cells according to their Raman spectra. The two buffer channels will converge cells (fluorescent dye replaces the cells to show the cell flow path) from a central channel and pass them through the Raman measurement window one by one (a). Because of the laminar flow and the special geometric design of the chip, cells will usually remain in the white flow (c) that channels them to the waste chamber (a) unless an optical force, for example, a 1064 nm infrared fibre laser (b) selectively pushes the cells of interest to another parallel flow, shown as the red-dye stained flow (c), that brings the cells the collection chamber. Microfluidic device based cell sorters are readily compatible with a Raman micro-spectroscopy system to achieve RACS.