［ 44 ］ QB 等 利用分子信标研究了 &’( 与单链 &’( 结合 图 +A 在活细胞中分子信标与 /’( 的杂交。将
蛋白 （ 66O ） 的相互作用， 开辟了利用分子信标核酸探针来 分子信标注射入细胞质后的袋鼠肾细胞荧光图 研究二者相互作用的新方法。他们研究了分子信标和 66O 结合 的 摩 尔 比 和 结 合 常 数， 对 于 66O 的 检 出 限 可 达
［ B］ 术相结合进行相关检测的报道： 如对沙门氏杆菌的半自动快速检测 ， 对牛奶和果汁中大肠杆菌 C@>D ： ［ D， F］ ［ "］ ［ @G ］ ED 的检测 ， 细菌人工染色体克隆的检定 ， * 染色体的精确测定 ， 对人体肺癌细胞中骨形成蛋白 ［ @@ ］ ［ @, ］ ［ @! ］ 受体 2?-’ 的识别检测 ， 对 EHI$@ 的定量分析 ， 以及对结核杆菌的检测 等。
"$$"($)(!* 收稿； "$$"(!!("* 接受 HI 代表荧光基团 （ 96D96E6-FE K58494DM496 ） ；NI 代表猝灭基团 （ 96D96E6-FE O86-7M69） 。
更稳定的碱基对氢键连接， 分子信标发生构型的变化， 干部分被打开， 从而使荧光基团远离猝灭基团， 荧
# J )" 基因变异的检测
［ @# ］ 传统的基因变异检测方法通常都很费时、 费力， 需要很多重复的移液、 离心、 培养、 分离等步骤 。 ［ @> ， @B ］ 基于分子信标基础上建立的快速检测方法的应用 使研究人员从这种繁琐的工作中解脱出来， 在很
大程度上提高了检测的效率和分析灵敏度。人们通过分子信标探针进行基因变异的快速检测， 从而研
（ #%$二甲基胺基苯基） 偶氮苯甲酸 （ &’()*+） 可作为分子信标通用的猝灭基团， 它对多种发射光谱不同
［ ,］ 。因此， 直接的能量转移可能是一种主要的荧光能量转移机制。 的荧光基团都有很好的猝灭作用
!" 分子信标的表面固定
最初设计的分子信标只能在均相溶液中检测靶分子， 因而极大地限制了它在生物医学及 &-’ 生物
评述与进展
!" 引" " 言
［ !， "］ !’’) 年， +,-.,/ 0/,12 等 设计了一种可以特异识别核酸序列的新型荧光探针， 这种荧光探针通
74- ） 。分子信标因其具有背景信号低， 灵敏度高、 特异性识别性强、 操作简单以及不必与未反应的探针
［ & ; &% ］ 分离即可实时检测等优点， 在短短的几年内得到了迅速的发展 ， 并已广泛地应用于实时监测聚合 ［ < ; != ］ ［ !* > "& ］ ［ &! ， &" ］ 、 基因突变的快速分析 、 ?@A、 B@A 的检测、 ?@A C B@A 杂交的动力学研究 以及 酶链反应 ［ && ; &) ］ ?@A C 蛋白质相互作用研究 等， 其应用领域仍在不断拓展。
#" 分子信标的原理
［ !］ 分子信标是一种由寡聚核酸形成的发夹型分子 （ 图 !） 。它包括一个环 （ 544D ） (干 （ EF6G ） 结构， 其
中环由与靶分子互补的核酸碱基序列组成， 一般有 !* ; "$ 个碱基； 干为两列互补的碱基序列， 一般是 * ; < 个碱基对。分子信标之所以能通过构象改变而 发荧光是基于它内在的环(干结构和荧光标记特征： 在分子信标中， 荧光基团共价地连接在其干部分的 一个末端， 猝灭基团也靠共价键连接在干部分的另 一末端。分子信标未与靶分子结合时， 由于干部分 # 图 !# 分子信标工作原理 两列互补碱基对之间的氢键连接， 使得荧光基团与 H21I ! # J92-72D56 4K 4D69,F24- 4K , G456785,9 L6,74猝灭基团距离很近， 荧光基团将能量转移给猝灭基 （ 3:） 团而发生荧光猝灭； 当分子信标与序列互补的靶分 子结合时， 环与靶序列杂交而形成了比干部分更长 光基团产生的荧光得到恢复。 分子信标这一荧光信号传导机制是基于荧光能量转移基础上的。可能有两种能量转移的形式存 在： 直接的能量转移和荧光共振能量转移。当荧光基团和猝灭基团距离很近时， 由于两个基团分子相互 碰撞可产生直接的能量转移。当两个基团的距离在 ! ; !$ -G， 且能量给体 （ 荧光基团） 的发射光谱与能
［ @， ,］ 分子信标非常适合于在 5)? 过程中监测 &-’ 的增长情况 。可以将分子信标简单地密封在
5)? 管中， 在每个循环的退火 （ /00:/4A01） 阶段通过荧光信号的大小监测反应的进行程度。在退火温度 下， 分子信标与扩增产物结合产生荧光， 未结合的分子信标不发荧光， 这样荧光信号随着反应循环的增 加而增强， 从而反映出 5)? 过程中扩增产物浓度的增加。由于加有分子信标的 5)? 管在整个反应中 是密封的， 因此可避免污染， 且操作简单易行， 检测灵敏度高。现在已有大量将分子信标探针与 5)? 技
究。亚甲四氢叶酸还原酶 （ MNE.?） 的某些基因的变异和许多心血管疾病以及神经管缺陷疾病的发病
［ @D O @" ］ 有关。结核分支杆菌的抗药性是防治结核病的难题， 几个研究小组 分别利用对变异基因的检测研
究了结核杆菌对利福平的抗药性。研究发现， 主要是由于细菌 9<3( 蛋白的一个 F@ 个碱基区域中某些 基因变异而产生了抗药性。其他研究还包括研究甘氨酸三甲内盐$同型半胱氨酸甲基转移酶的变异而
过与核酸靶分子进行杂交后发生构象的变化而发出荧光， 他们将其命名为分子信标 （ 3456785,9 :6,(
第> 期
江雅新等： 一种新型荧光探针— — —分子信标的研究及应用进展
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［ !" ］ 量受体 （ 猝灭基团） 的吸收光谱有较大程度的重叠时， 则可发生荧光共振能量转移 。由于已发现 #$
［ >］ 基团连接到一个 )56 （ 73089344:; <39: 14/==） 球上的方法也可以实现分子信标在 )56 上的固定 。固定
分子信标的方法为分子信标生物传感器及分子信标生物芯片的研究奠定了基础， 也使分子信标更广泛 地应用于生物体系。
#" 分子信标在生物分子检测中的应用
#$ %" 实时监测聚合酶链反应 （ &’(）
［ ,D ］ +AR 等 将生物素化的 &-’ 分子信标固定在光纤表面， 制成了渐消逝波激发的 &-’ 分子信标生物传
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分析化学
第 4+ 卷
感器。然而， 由于所使用的光纤比较大 （ !! 级） ， 其检测的灵敏度受到影响。后来， 采用光纤针尖端固 定分子信标直接激发， 获得了更为灵敏、 微型化 （ !! 及 "#$%!! 级） 的 &’( 分子信标生物传感器。利用 获得的光纤针尖图像， 可以监测杂交的动力学过程。用这种灵敏的传感器制 增强型电感耦合器 （ )**&）
［ ,G ］ ［ ,@ ］ 引起的高同型半胱氨酸症 、 线粒体 &-’ 变异引起的一些线粒体疾病 、 恶性疟原虫中 P@GF- 点的 ［ ,, ］ 变异 等方面， 从而使分子信标在疾病诊断和医学研究等方面具有广泛的应用。
# J !" 分子信标生物传感器 &-’ Q ?-’ 的分析在分子生物学、 基因学及药物学研究中都具有重要的地位， 基于 &-’ 杂交基础
子信标， 对单个活细胞中的 /’( 进行了检测， 并利用 )**& 成像系统得到了一系列反应分子信标与 /’( 结合的荧光图像 （ 图 +） 。这些结果表明， 利用分子信标可以有效地实时检测活细胞中的 /’( 及 研究 /’( @ &’( 的杂交过程。 ! . &" ’$%(蛋白质相互作用研究 两类重要的生物大分子%&’( 和蛋白质的相互作用控 制着许多生物过程。因此， 对二者相互作用的研究， 是目前 分子生物学和生物技术研究中非常重要并迅速发展的领 域。由于目前所用分析方法的限制， 人们还尚未完全了解 &’( 和蛋白质相互作用的细节及其对整个生物体系的作 用， 将分子信标应用于这一领域的研究， 可使人们的认识更 加深入。
［ 4T ］ +. 5 R 95 S 95 !38 @ Q。同时， D1CE 等 还研究了乳酸脱氢酶
像， （ 1）4 !BC， （ $）9+ !BC
DBE. +A FG$?BHBI12B3C 3J 2K> !38>L#81? $>1L3C" 23 ?B% $3C#L8>BL 1LBH（ /’(）BC 8BMBCE L>88". D8#3?>"L>CL> B!1E> 3J 1J2>? BCN>L2BCE 0O BC23 2K> LG23P81"! 3J
［ ,! O ,B ］ 上的核酸生物传感器是在这个领域中发展非常迅速的主要技术 。这些传感器都是用固定的 &-’ ［ ,! ， ,# ］ 探针来进行核酸的特异性结合与识别。荧光检测技术的应用使 &-’ 传感器的灵敏度得到提高 ，
但是由于需要对被检测靶分子进行标记等限制， 使得它难以对一些杂交体系进行动力学的实时监测。
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分析化学（ HP@QR STAQTP） # 评述与进展 UM2-6E6 V489-,5 4K A-,5/ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ27,5 UM6G2EF9/
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