常规微生物学试验曾占壮•消毒与灭菌•病原菌的分离、纯化与保存•细菌鉴定•细菌的药物敏感性试验消毒与灭菌一、概念1. 消毒：是指杀死或消除所有病原微生物的措施，可达到防止疾病传播的目的。

例如将物体煮沸（100℃）10分钟或60-70℃加热处理30分钟，就可杀死病原菌的营养体，但绝非杀死所有的芽孢，常用于牛奶、食品以及某些物体表面的消毒。

利用具有消毒作用的化学剂（又叫消毒剂，disinfectant），也可进行皮肤、体膜或体内的处理。

2. 灭菌：是指用物理或化学因子，使存在于物体中的所有生活微生物，永久性地丧失其生活力，包括最耐热的细菌芽孢。

这是一种彻底的杀菌措施。

通过灭菌的物品不再存在任何有生命的有机体。

二、常规灭菌方法（一）加热法干热灭菌（1）火焰灼烧灭菌：适用于接种环、接种针及金属用具、无菌操作时的试管口和瓶口的灭菌。

（2）热空气灭菌：即通常所说的干热灭菌，是在电烤箱内利用高温干燥空气进行灭菌，适用于玻璃器皿的灭菌。

湿热灭菌（1）高压蒸汽灭菌：将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，在一定压力的环境下经过一定的时间的灭菌方法。

灭菌压力的大小和时间的长短可根据灭菌物品的种类和数量的不同而有所变化。

此法适用于培养基、工作服、玻璃器皿等的灭菌。

（2）常压蒸汽灭菌：在不具备高压蒸汽灭菌的情况下，常压蒸汽是一种常用的灭菌方法。

对于不易用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用此法灭菌。

由于压力为常压，其温度不超过100℃，仅能使大多数微生物被杀死，而产芽孢细菌却不能在短时间内被杀死，因此可采用间歇灭菌的方法以杀死芽孢细菌，达到彻底灭菌的目的。

（3）煮沸消毒法：注射器和解剖器械等可采用此法。

一般煮沸时间为10~15min，可以杀死细菌所有营养细胞和部分芽孢。

如延长煮沸时间，并在水中加入1%碳酸氢钠或2%~5%石炭酸，效果更好。

（4）超高温杀菌：是指在温度和时间标准分别为135~150℃和2~8s的条件下对牛乳或其他液态食品进行处理的一种工艺，其最大优点是既能杀死产品中的微生物，又能较好地保持食品品质与营养价值。

此法的原理是建立在食品品质及营养成分等，不遭受热力破坏的温度与微生物受热死亡的温度两者之间差异很大的规律上的。

（二）过滤除菌1. 应用于血清、抗生素、糖溶液等易受热破坏的物质的灭菌。

2. 过滤器蔡氏过滤器：据其孔径大小可分为三种型号。

（1）k型—孔径最大，作一般澄清用；（2）EK 型—滤孔较小，用以一般细菌的滤除；（3）EK-S型—滤孔最小，可阻止大的病毒通过，使用时可根据需要选用。

微孔滤膜过滤器：最常用的过滤器，其滤膜为醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的薄膜，孔径分0.025，0.05，0.10，0.20，0.22，0.30，0.45，0.60，0.65，0.80，1.00，2.00，3.00，5.00，7.00，8.00和10.00μm，实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为0.22 μm，但若欲滤除病毒，则需更小孔径的微孔滤膜。

（三）辐射灭菌•紫外线灭菌：在微生物工作及生产实践中应用较广。

无菌室或无菌接种箱或超净工作台的空气或台面可采用此法灭菌。

•60Co—γ射线灭菌：广泛应用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜、各种积层材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌。

此法的优点为穿透力强，可在厚包装完好的条件下灭菌。

（四）化学药品灭菌化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。

能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂；只是抑制细菌代谢机能，使细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂。

化学药品对微生物的作用是杀菌还是以军以及作用效果还与化学药品浓度的高低、处理微生物时间的长短、微生物的种类以及微生物所处的环境等有关。

三、自动立式压力蒸汽灭菌器操作规程1. 放入待灭菌物品：把灭菌物品予以妥善包扎，各包之间留有间隙，保障其气路畅通；2. 接通电源；3. 加水：把生活用水从灭菌桶与蒸锅夹缝内加入至高水位灯亮；4. 设定灭菌温度：按动控制面板上增加键或减少键，在绿色数显上设定所需温度，按动移位键进行移位设定，当每次设定所需温度结束时，按确认键确认，即可完成设定；5. 设定灭菌时间：温度设定完毕且确认后，绿色温度数显状态自动切换成时间状态，再用增键或减键±，设定所需的灭菌时间，设定完毕后，按确认键确认；6. 密封：堆放与开机程序设定完成后，将压板推入固定柱内，应注意压板必须全部推到固定柱内，然后将手轮向右旋紧，使盖与主体密合；7. 灭菌：关闭放气阀及下排气阀，当压力表指针升至0.05Mpa时，开启放气阀排气至压力表指针回复0位，关闭放气阀，当压力表指针升至0.1~0.15Mpa之间后, 开启下排气阀让微量的蒸汽通过下排气阀在整个灭菌过程中不断排出；8. 灭菌物品取出：灭菌结束时，必须先将电源切断，停止加热待其冷却，直至压力表指针回复至零位，打开放气阀排去余气，才能将盖开启。

病原菌的分离、纯化与保存一、病原菌的分离选取具有典型症状的病体或病灶组织，对于体表或鳃，先经无菌水洗涤后用接种环挑取少量组织；对体内组织、器官，先用酒精将病鱼胸腹部进行大面积消毒，再经无菌水洗涤后，在无菌条件下，从肛门附近剪开一个缺口，沿腹部左侧和右侧向上剪去胸腹壁暴露脏器，以70％的酒精药棉消毒脏器并经无菌水洗涤后，接种环穿刺挑取少量组织。

然后划线接种于预先准备好的培养基上，25~37℃培养24~48小时，选取形状和色泽一致的优势单个菌落，重复划线分离培养以获得纯种。

接种用具包括接种环和接种针，由环（针）、金属柄和绝缘材料三部分组成。

制作接种环（针）的材料要求硬度适宜、易于传热，火焰灼烧后能较快冷却，以铂丝最佳，但因其价格昂贵，现多用镍铬丝。

环的直径为2~4mm，长5~8cm。

操作环境1. 无菌室是实验室内部安装的用于无菌操作的工作室，一般需安装两道以上的门，内外室均有紫外线杀菌灯、照明灯，内室（即操作室）还要有电源插座。

本实验室无菌室操作流程：开紫外灯灭菌10~15mi n→人员进入一更→换鞋→进入二更→更换衣服→进入操作室进行相关试验操作2. 超净工作台通过空气过滤装置使工作台内部保持无菌状态。

超净工作台的滤网（初效过滤器）应定期清洗，清洗周期一般为３～６个月培养设备1. 电热恒温培养箱：用于培养普通需氧或兼性厌氧菌。

温控范围在室温以上，无致冷作用。

2. 生化培养箱：用于培养普通需氧或兼性厌氧菌。

温控范围广，有致冷作用，能将培养温度设置在室温以下。

3. CO2培养箱：用于分离培养生长时需CO2的细菌，如嗜血杆菌和奈瑟氏球菌等。

4. 厌氧袋、厌氧罐和厌氧手套箱：用于分离培养厌氧菌。

5. 摇床和振荡培养箱：用于液体培养。

病原菌的分离方法1. 平板连续划线分离法此法适用于含菌数量较少的样品。

接种时，先将样品涂于琼脂平板的一角，然后用接种环自样品涂布部位开始，连续划成若干条分散的平行线。

2. 平板分区划线分离法此法适用于含菌量较多的样品。

（1）用接种环先将样品涂布在平板第一区并作数次划线；（2）接种环灼烧并冷却后依次在第二、三、四区作数次划线；（3）每一区域的划线应接触上一区域的接种线3~5次，使菌量逐渐减少，以利出现单个菌落；（4）接种环的灼烧次数依样品的含菌量而定，并非每划一区都需灼烧。

3. 液体培养基培养法此法主要用于含菌量较少的样品的增菌培养。

（1）用灭菌接种环挑取少量样品；（2）在试管内壁与液面交界处轻轻研磨，使样品混匀在液体培养基中。

二、细菌的纯化纯化：微生物学中将在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物，而只有一种微生物的培养物称为纯培养（物）。

获得微生物纯培养的过程即为纯化。

纯化是分离的延续。

微生物纯化方法：同分离方法。

三、菌种的保藏（一）菌种保藏的原理菌种保藏的具体方法很多，原理却大同小异。

首先要挑选典型菌株的优良纯种，最好采用它们的休眠体（如分生孢子、芽孢等）；其次，还要创造一个适合其长期休眠的环境条件，诸如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸度中和剂等。

一种良好的保藏方法，首先应能保持原菌的优良性状不变，同时还须考虑方法的通用性和操作的简便性。

（二）菌种保藏的常用方法1. 传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用）。

斜面保藏法是一种最基本的方法，适用范围广，细菌、真菌及放线菌都可应用。

当微生物在适宜的斜面培养基和温度条件下生长良好后，保存在4~6℃的冰箱，一定时间后重新移种一次。

一般菌种可保藏3～6个月。

当然保藏温度和时间都不是绝对的，个别菌种甚至在37℃保藏为宜，也有的需要1～2周传代一次。

这种方法的优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等；弊端是传代次数多了容易发生变异，如毒力减小、基因失落等，传代次数多也容易使污染机会增加。

2. 液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

主要适用于霉菌、酵母菌、放线菌、需氧性细菌等的保存。

3. 载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法。

1）土壤保存法：主要用于形成孢子回孢囊的微生物的保存，特别适用于真菌和放线菌不改变性状的长期保存。

2）砂土保存法：常用于梭状芽孢杆菌和一部分霉菌的保存，可保存数年。

3）硅胶保存法：本法对保存链孢霉菌较有效,对酵母菌的保存也较有效。

4）磁珠保存法：用本法保存根瘤菌在室温下至少可保存2年半。

5）滤纸保存法：适用于对干燥抵抗力较强的微生物，如产芽孢细菌和葡萄球菌，另外噬菌体、放线菌和丝状菌也可用本法。

4. 悬液保存法1）蒸溜水保存法：霉菌、酵母菌和放线菌的大部分，使其悬浮于蒸馏水中，可在室温下保存数年，青枯病假单孢杆菌也可用本法。

2）糖液保存法：过去用于保存酵母菌，但现在已不常用。

3）其他悬液保存法：如乳链球菌可用PBS保存，放线菌可用0.125%稀琼脂液保存。

5. 寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。

病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

6. 冷冻保藏法可分低温冰箱（-20~-30℃，-50~-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。

7. 冷冻干燥保藏法使微生物在冷冻状态下，在减压下利用升华现象除去水份（真空干燥），使细胞的生理活动事实上停止，从而长期维持生活状态，本法适用于大多数细菌和放线菌，另外病毒、噬菌体、立克次氏体、霉菌和酵母菌在多数情况下用本法保存。