色谱柱使用常识
1.色谱柱的安装
⑴、用过滤和脱气的流动相（不含缓冲盐）彻底冲洗色谱仪的泵和管路，务必使系统中不含气泡。
⑵、根据色谱柱上所标示的流动相流向，将色谱柱入口与泵端管路相连，柱出口不连。
⑶、将泵的流速设为0.1mL/min或更低，流速缓慢地上升到正常流速（t>5min）。
⑷、当溶剂从色谱柱出口端自由流出时，将流速设为0，把柱出口与检测器端的管路相连。
⑸、用10－30倍柱体积的流动相、正常流速平衡色谱柱。
⑹、氨基柱、氰基柱既可在正相环境下使用，也可在反相环境下工作。
当需要从反相变为正相或正相变为反相时，需要用20－30倍柱体积的THF作为过渡溶剂冲洗系统，否则易使泵的单向阀堵塞，出现压力异常的现象。
2.色谱柱使用注意事项
①、流动相：
a、溶剂必须是HPLC级的，试剂则尽可能使用高纯度的；
b、不与固定相发生化学反应，粘度小，且对样品有适宜的溶解度，要求k在1～
10范围内（可用范围）或2～5（最佳范围），k值太小，不利于分离；k值太大，可能使样品在流动相中沉淀；
c、流动相使用之前必须过滤和脱气；
d、确保溶剂间是相互混溶的；
e、流动相必须与检测器相匹配，如用紫外检测器时，不能选用截止波长大于检
测波长的溶剂。
痕量的杂质会极大地降低色谱柱的性能，当需要更换流动相时，确保溶剂（缓冲液）之间是相互混溶的。
若使用的溶剂与色谱柱中的溶剂不能混溶，则需使用过渡溶剂，否则会对色谱柱产生永久性的伤害。
盐或缓冲液从流动相中析出也会对色谱柱产生永久性的伤害。
每次进样前应该检查样品在流动相中的溶解性，如果可能尽量使用流动相溶解样品。
②、固定相：
a、流动相的pH值应保持在2.0－8.0之间（除非有特殊说明）；
b、如果有必要可使用预饱和柱和保护柱；
c、使用氨基柱时，流动相和样品中尽量避免含醛类和酮类物质。
当前的反相色谱柱填料可分为以下三种：
⒈硅胶柱：柱效高，机械强度大，但对pH敏感，低pH值(<2.0)会使键合相水解（除去键合的功能集团）；高pH值（>8.0），硅胶溶解。
如果流动相的pH值接近2.0或8.0，需要使用预饱和柱。
⒉有机聚合物填料：在宽pH范围内稳定，残留硅羟基效应较小；但其柱效低，机械强度不高，在不同的溶剂中可能缩水或溶胀。
在应用过程中，压力绝对不能超过其最大能承受的限制，且流动相中有机溶剂如甲醇、异丙醇、乙醇的含量不能超过10％。
⒊有机－无机杂化粒填料：新开发的一种新型填料，由两种高纯的单体（有机聚合物和无机硅烷）合成的高纯度填料，此类填料将硅胶填料和有机聚合物填料的优点有机地结合起来，柱效高、机械强度高、稳定性好、pH范围宽，特别是表面和颗粒内部的硅羟基大部分被有效的屏蔽，使其对碱性物质的保留性能非常好。
③、背压（backpressure）和流速：
a、保持背压低于3500psi（245bar）；
b、避免任何突然的压力变化；
c、如果背压高（>3500psi），可反冲色谱柱，但流速应为正常流速的1/5-1/2；
d、如果检测池需要除气，可以使用背压调控器（backpressure regulator）。
为最大限度的延长色谱柱的寿命，可根据色谱柱的填料的粒径、色谱柱的内径对流速进行调整，使得背压<3500psi。
如果背压不超过界限，色谱柱的流速可任意设定
表1 粒径、内径、流速和背压之间的关系 粒径（µm） 内径（mm） 流速（mL/min）150mm 250mm
3 5 5 5 5 5 10 10 4.6
1.0
2.0
3.2
4.6
10.0
4.6
21.2
0.5
0.1
0.2
0.5
1.0
5.0
2.0
20.0
985
1500
750
732
710
750
355
170
1640
2500
1250
1226
1180
1250
590
280
④、上样量：
色谱柱的最大载样量取决于柱子的尺寸、使用的条件和样品的类型，因此很难给出一个明确的值。
而最大进样体积则比较容易确定（见表中的典型值）。
进样体积太大或样品浓度过高会使得峰展宽或峰融合。
表2 柱尺寸与最大上样体积
柱尺寸（长度*内径）最大上样体积
250×2.0mm 200×3.0mm 250×4.6mm 250×10.0mm 10μL 15μL 50μL 250μL
⑤、参数的缩放：
为保持保留时间的重现性，可根据色谱柱内径的不同来调整流速和上样量。
Scale factor（缩放因子）＝（radius column B/ radius column A）2 表3 内径与缩放因子间的换算（以4.6mm内径的色谱柱为标准）
内径（mm） 缩放因子
1.0
2.0
3.2
10.0
21.2 0.05 0.2 0.5 5.0 21.0
⑥、柱温：
大多数分离工作是在室温下进行的，如果实验室的温度保持不变的话没什么问题，但大多数工作环境的温度会有波动，这对方法的实验室间重现性非常不利。
温度对等度分离的保留时间有影响，一般来说，每增加1℃，保留时间就减少1－3％。
即使在温度控制、日夜恒温的环境下，由于昼夜温差的影响，室温也会发生较大的变化，特别是在进行大批量的样品分析时（如人体药代或生物等效性试验），能使保留时间发生较大的变异。
与等度洗脱相比，梯度洗脱的保留时间对温度的变化较不敏感。
温度的变化会引起色谱柱对所要分离物质选择性的变化，这种变化取决于化合物的性质，所以可通过控制温度来实现化合物的分离。
色谱柱温度平衡得不好，会使得峰展宽。
柱温变化，保留时间和柱选择性发生变化，峰宽随之变化，柱温升高使得理论塔板数增大，峰变窄，灵敏度增高。
如果色谱柱、溶剂瓶、泵和自动进样器都在室温下工作，则整个系统的温度是一致的。
如果对色谱柱进行加热，而溶剂和系统的其它部分在室温下工作，会使得色谱柱入口的温度低于出口的温
度，这种温度梯度对峰形不利。
解决的办法可以在自动进样器与柱子之间加一个预热器（preheater），如有些商品化的柱温箱已经带预热器了。
如此一来，有些峰展宽和峰拖尾的原因就比较好解释了，色谱带的前缘温度高于后缘，所以移动的速度也就较快，因而产生峰展宽和峰拖尾。
现在使用预热器来改善峰形是较普遍的方法。
⑦、色谱柱的贮存：
a、 柱的贮存条件影响柱寿命，贮存液中至少应含有20％有机溶剂，以防止微生
物的滋生；
b、绝对不能用缓冲液贮存色谱柱；
c、用5倍柱体积的不含缓冲液的流动相冲洗色谱柱以去除缓冲液和盐。
表4 不同类型硅胶柱的贮存条件
色谱柱类型 贮存溶剂
反相柱（C18、C8、C4）
正相柱（Silia、CN、NH2） 离子交换柱
尺寸排阻色谱柱 乙腈﹕水＝65％﹕35％ 异丙醇或己烷
甲醇
0.05％NaN3或10％甲醇
⑧、色谱柱的清洗：
在进行任何清洗过程之前，务必弄清楚柱中的溶剂与你所要用的清洗溶剂之间是否是相互混溶的，且流速也需设为正常流速的1/5-1/2。
表5 色谱柱体积（mL）
内径柱长（150mm）柱长（250mm）
2.1 4.6 10.0 22.5 0.3
1.8
6.5
35.0
0.5
2.2
9.3
49.3
⑴有机流动相：
a、未键合的硅胶：己烷（20）* →二氯甲烷（20）→乙腈（20）→二氯甲烷（15）
→己烷（10）；
b、极性键合相（CN、NH2）：二氯甲烷（20）→异丙醇（20）→甲醇（20）→
异丙醇（15）→二氯甲烷（10）；
c、非极性键合相（C18、C8、C4）：乙腈（20）→二氯甲烷（20）→己烷（20）→
二氯甲烷（15）→乙腈（10）；
⑵水相流动相或水/有机溶剂流动相：
a、离子交换柱：流动相缓冲液（20）→流动相中缓冲液浓度1－5倍的增加**（20）
→色谱级的纯水（20）→0.1M EDTA（20）→色谱级的纯水（20）→乙腈（20）→色谱级的纯水；
b、极性键合相：
⒈氰基柱：色谱级的纯水（20）→乙腈（20）→二氯甲烷（20）→乙腈（15）→
色谱级的纯水（20）；
⒉氨基柱：流动相（20）→色谱级的纯水（20）→流动相（20）；
c、非极性键合相：
⒈普通样品分析：不含缓冲盐的流动相（20）→乙腈（20）→二氯甲烷（20）→
乙腈（15）→不含缓冲盐的流动相（15）；
⒉生物聚合物或蛋白质/多肽分析：不含缓冲盐的流动相（20）→梯度洗脱3次
（A：含0.1％THF的色谱级纯水，B：乙腈∶异丙醇＝1∶2，其中含0.1％THF；
30分钟内B由25％→100％）***。
说明:
*括号内的数字为所需溶剂的柱体积数；
**缓冲盐的浓度不超过2M
***如果没有改善的话，可在原先的基础上尝试以下操作（仅适用于聚合物键合∶异丙醇＝1∶4（40）→水∶异丙醇＝1∶4（40）。
相）：0.1N HNO
3
****本文内容根据Phenomenex、Alltech、Waters公司的技术资料编译、整理而成，如有疏漏，敬请指正。
可PM或发邮件给我xxb_6410@。