常用的包埋剂
具有低黏度、亲和性强和优良的切割性能， 切片透明度高，组织结构保存好，并能耐受 电子束的轰击及在低温下聚合的特点。
• 环氧树脂Epon812(进口) 渗入组织容易，对细胞结构保存好，较 常用。 • 丙烯酸酯（acrylic resin) 618(国产)
Lowcryl K4M：
为低温水溶性包埋剂，较常用。特点是低温下(-35 ℃) 可保持低黏度；在紫外光（波长360nm）下可聚合。聚合后 可在常温下切片；能较好地保持组织结构和抗原性及植物凝 血素结合部位，减少背景非特异性染色，故多用于免疫细胞
• 可使核酸、蛋白质、结缔组织纤维的反差增强。
–0.1％～0.4％柠檬酸铅
• 可使膜结构、脂类的反差增强。
正染色
TEM样品：
①超薄切片厚度要均匀 ②无震颤 ③无刀痕 ④无染色污染 ⑤反差适当
负染技术
• 指利用重金属盐类与结构背景 相结合，增加背景电子散射能 力，使背景呈黑色，样品结构 变亮。
• 操作步骤（以全身灌流固定法为例） 麻醉要进行灌流的动物,将动 物固定于实验台上,打开胸腔暴露 心脏,将针头刺入左心室，剪开右 心耳以引出血液和灌流液。用注射 器或输液器缓慢注入37 ℃、 0.9%NaCl,直至内脏血色消失或流 出液无血色为止,注入4 ℃固定液， 待组织变硬后取材。
体外培养细胞的固定
多聚甲醛(Paraformaldehyde)
• 白色粉末，使用浓度为4％ • 优点 –对组织的浸透力强 –保存抗原性物质，多用于免疫电镜技 术中 • 缺点 –高浓度时可使组织结构流失，多不单 独使用
常用缓冲液
• 用于配制固定液和漂洗
0.2M磷酸盐缓冲液:较常用 0.2M二甲砷酸盐缓冲液:用于电镜细胞化学
五.切片
• 目的：制备厚度小于100nm的切片 • 准备工作: 1.复膜载网
• 支持膜 –formvar膜 –火棉胶膜 –碳膜 用于负染技术 • 支持网 –铜网 常用 –不锈钢网、镍网、铂网（组化用）
2.制刀
3.修块 –目的是去除组织块周围多余的包埋介 质，便于切片。 • 半薄切片: –目的是确定所要观察的准确部位，厚 度为0.5～1μ m，用甲苯胺兰染色显示。
浸泡固定法
是将所取样品直接放入预冷固定液内固定 的方法，适用于大多数组织器官。最常用的 是戊二醛、锇酸双重固定。 操作步骤:
前固定： 2.5%-4%戊二醛
后固定：1%锇酸 漂洗： 蒸馏水 4℃
4℃
1-2h或数月
2-4h 中间换3次 30min） 10min
漂洗：用配固定液的缓冲液 4℃ 4℃
1.5-2h（培养细胞
支持膜的制作
支持膜是一种能支持观察样品的膜，厚度 约20nm。性能良好的支持膜应具备： 1.较高的透明度 2.在电镜下无可见结构
3.与所支持的各种样品不发生化学反应
方华膜、碳膜、火棉胶基底碳膜、硝化纤维素基底碳膜、微筛膜等
支持膜的制作
方华膜（方华的
化学成分是聚乙 烯醇缩甲醛，为 淡黄色粉末）： 准备-附膜-漂膜-
• 浸透
–环氧丙烷 室温 –环氧丙烷:包埋剂 1:1 –包埋剂 室温 20min 室温 3h 40-60min
• 包埋
–将样品放入包埋板或胶囊内 –放好标签 –充填满包埋剂
• 聚合(使包埋剂变硬)
35 ℃ 45 ℃ 55 ℃ 12h 12h 12h
2.原位包埋法
适用于组织块中数量少的特殊结构，如： 运动终板；冷冻切片、半薄切片及单层培养细 胞的某些结构的观察. • 1、组织块：前固定后用振动切片机切成50100μ m的厚片，显微镜下选出含有所需结构的 厚片进行漂洗。经过1%锇酸后固定，乙醇及 丙酮系列脱水，环氧树脂浸透，把厚片铺于载 玻片上，将顶端平整的废包埋块安在切片的特 定部位上，60 ℃聚合后修块，常规切片及染 色。
• 超薄切片:采用超薄切片机
–操作步骤: •包埋块固定 •刀固定 •水槽加水 •切片 •选片 •捞片
切片带弯曲可能原因及解决办法
可能原因 梯形或矩形组织面上下边不平行 刀刃锋利程度不一
解决办法 用双面刀片重新休整组织切面使之平行 更换新玻璃刀
组织面上边或下边与刀刃不平行
重新调整组织与刀刃距离，使之平行
Fig. 4. Colloidal gold nanoparticles (20 nm). 1: anti-TTX Mab labelled colloidal gold nanoparticles (showing the protein halo around the labelled nanoparticles), 2: unlabelled colloidal gold nanoparticles.
锇酸(Osmium tetroxide OsＯ4) • 淡黄色块状结晶，使用浓度1～4％， 使用温度4℃。 • 优点 –对蛋白质和脂类有较好的固定作用 –可避免组织块收缩或膨胀 –可产生明显的反差
锇酸(Osmium tetroxide OsＯ4)
• 缺点 –分子量大，穿透能力差 –对碳水化合物和酶固定效果不好 –固定时间较长易引起组织变脆 –有强烈的刺激味对角膜、鼻粘膜有毒性作用 –光热作用时易发生变化
一.取材
• 从人体、动植物、细胞和微生物的培养物中 选取电镜观察材料的过程。 • 在活体取材时要做到： •快─离体1～2min内放入固定液 •准─取材部位要准，有代表性 •小─1mm×1mm×1mm大小，太小时结构少， 太大时固定不充分结构保存不好 •轻─动作要轻，器械要锋利 •冷─0℃ ～ 4℃ ，器械、容器、固定液 均需预冷
原位固定法
• 多用于解剖关系比较复杂、质地柔软或对 缺氧比较敏感的组织。以保证器官的血液 供给，避免缺血造成的组织损伤或自溶。 • 操作步骤 在动物麻醉后保持血液供应的条件下， 边解剖边在取材的部位局部滴加固定液， 直至组织达到适当的硬度为宜。
灌流固定法
• 指通过血液循环途径，将固定液灌 注到组织器官内，进行固定后再取材的 方法。常用于对缺氧敏感，死后变化快 的组织器官，如中枢神经系统、心脏、 胃肠道、视网膜和肾脏等。也可用于所 取组织的种类较多以及解剖关系比较复 杂、难以渗透的组织器官。 • 包括全身灌流固定法（适用于小动 物）和器官灌流固定法（适用于大动 物）。
二.固定
• 目的
–尽可能保存组织和细胞在生活状态下的结构 –使细胞内的各种成分固定下来，避免在以后 的冲洗和脱水等步骤中溶解和流失 –防止细胞内酶活性造成的细胞自溶 –防止外界微生物侵入繁殖而产生腐败致使细 胞的超微结构遭受破坏
• 方法
–物理方法 •快速冷冻法 •干燥法 –化学方法 •浸泡固定法 •原位固定法 •灌流固定法
• 2 、切片及单层培养细胞（需要在玻片上进 行）： 在光镜下选出所需观察的部位，在玻片反面 用笔做好标记。前固定、漂洗、后固定，脱水 及浸透同常规包埋方法，但各步骤时间可适当 缩短。在玻片有标记处的正面位置滴上包埋剂， 将顶端平整的废包埋块压在其上，于60 ℃聚合 硬化。将粘有包埋块的玻片置于90 ℃热板上加 温10s，取下包埋块修块，超薄切片及电子染色。
染色剂
磷钨酸（PTA） pH 6.7-7
染色步骤
复膜载网－滴样品-滴染1-2min－用滤纸 吸去染液－观察
优点
适用于悬浮液的样品（细菌、病毒、其他 微生物、大分子、分离细胞器） 操作快速、简便 样品用量少 图像结构反差好
小结：（超薄切片） 1.取材:要求部位准确,块小,时间短,低温,器械锋利, 减小机械损伤. 2.固定:戊二醛固定时间可以适当延长,一般不要超过 一周,期间要更换一次固定液,且要保持低温固定,充 分清洗后再进行锇酸固定1-2小时,时间一定不要太长. 3.脱水:锇酸固定后经过充分清洗,进行酒精梯度脱水, 一般50%,70%,80%,95%,无水酒精, 4.样品侵透,包埋.一定要保持干燥,侵透彻底. 5.聚合:由室温到高温梯度升温聚合.如35度,45度,60 度顺序. 6.超薄切片:切片机性能,片厚度,捞片,载网质量都需 要注意. 7.电子染色:过程中一定要避免一切污染.
超薄切片质量好坏指标
• 样品结构保存良好，结构细腻，无丢失。 • 切片厚薄均匀，厚度在60-90nm之间。表面 无皱折、刀痕、震颤等缺陷。 • 样品反差良好，无染色沉淀。 • 支持膜厚度适中，观察时不产生漂移和破裂。
六.电子染色
• 利用重金属盐类选择性地与生物样品中不同 结构成分相结合，来提高结构成分散射电子 的能力，从而增加图像反差的染色，又称为 正染色。 • 常用的染色剂: –0.5％～１％醋酸双氧铀
四.浸透及包埋
• 浸透：目的是使包埋剂逐渐取代脱水剂
渗透到组织细胞中。因包埋剂与脱水剂不 相溶，需用一种既能与脱水剂相溶，又能 与包埋剂相溶的物质进行转换，常用的转 换剂为环氧丙烷。
• 包埋：目的是让包埋剂完全浸透到组织
细胞内部，使组织具有一定的硬度、弹性 和韧性，能够承受切片时的各种压力，以 便制备超薄切片.
生物医学样品的特点：
1、样品多样化，包括组织、细胞、微生物及生 物大分子。 2、含水量多、质地软、脱水时容易皱缩变形。 3、机械程度低，对电子束轰击的耐受力差。 4、多由低原子序数的元素组成，故导电性能差。 5、样品形态对试剂的PH值及温度较敏感
主要步骤
• 取材 • 固定 • 脱水 • 浸透及包埋 • 切片 • 染色
注意事项 （负染） 样品浓度要适中 样品要不含杂质 样品的pH值要与染液pH值一致 掌握滴染时机（样品要未完全干燥时） 负染样品观察时，加速电压要适当,物镜 光阑要小，反差较好，照相要快.
Fig. 1. The labelling results of colloidal gold probe. A: colloidal gold, B: labeled colloidal gold (showing the protein halo around the labeled particles).