甲硝唑片微生物限度检查
方法确认方案
产品名称：甲硝唑片
产品编号：
验证项目：微生物限度
文件编码：
验证时间：年月日～年月日
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你的签名表明你已清楚了解本方案及附件内容，充分理解并认可本方案。

确认方案审核
确认方案批准
目录
1.简介 (1)
1.1.验证目的 (1)
1.2.适用范围 (1)
1.3.依据的法律法规 (1)
2.概述 (1)
3.验证小组组成及职责 (1)
3.1.验证小组成员及方案会审 (1)
3.2.验证小组职责 (1)
3.3.人员确认 (2)
3.4.验证培训 (2)
4.验证内容 (2)
4.1.验证准备 (2)
4.2.菌液制备 (4)
4.3.供试液制备 (4)
4.4.计数方法适用性试验 (5)
4.5控制菌检查方法的验证：大肠埃希菌 (6)
5偏差及结果评估 (7)
6验证结论 (7)
1.简介
1.1.验证目的
验证所采用的需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法适合该药品的微生物限度检查。

1.2.适用范围
适用于本厂生产的甲硝唑片（规格：0.2g）的微生物限度检验方法的验证。

1.3.依据的法律法规
《中国药典》2015年版四部
2.概述
根据《中国药典》2015年版四部要求在建立药品的微生物限度检查法时，应进行需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法的验证，以验证所采用的方法适合于该药品的需氧菌、霉菌及酵母菌数的测定和控制菌检查；不同检品、不同的仪器或材料等均可能对检验结果产生影响，当检品有抑菌性时，会掩盖已受检品污染的事实或造成低于实际污染水平的检测结果；选用不适当的培养基，其促生长能力不符合要求，也会造成类似的后果；若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检验方法应重新验证；因此为了使微生物限度检验方法的结果准确可靠，需要对检品的具体检验方法进行验证，以证明其对检品的适用性。

3.验证小组组成及职责
3.1.验证小组成员及方案会审
您的签名表明您已审阅并同意本验证方案，并保证按文件要求实施验证，观察并做好验证原始记录，对实施验证的结果负责。

3.2.验证小组职责
负责承担本验证项目的具体实施工作，包括验证立项提出、验证方案的起草、验证的实施、验证报告编写等工作。

●组长：根据验证计划安排，负责项目验证立项提出，组织验证小组人员起
草验证方案并按方案要求实施验证。

负责各阶段验证结果汇总及评价，起
草验证报告、整理验证档案，组织相关的验证培训。

对整个项目验证负责。

●副组长：协助组长工作，督促验证小组成员按照验证方案的要求做好验证
记录，并对验证方案中的验证方法、有关试验标准、验证过程及实施结果
符合GMP规范及有关标准进行审核，有关检验记录的审核、偏差的审核。

●成员：在验证小组的领导下，负责按各自的职责范围内完成验证方案的起
草、会审，验证的具体实施，对验证的结果进行记录，对实施验证的结果
负责。

3.3.人员确认
确认有关检验人员、监督人员有专业检验证书并均经过岗位培训,并取得上岗证。

检查人/日期：复核人/日期：
3.4.验证培训
验证实施前，验证方案及验证中应该掌握的技能应该对验证小组成员进行培训。

培训应遵循《培训管理制度》。

培训记录存入验证档案。

培训主持人：日期：
确认人：日期：
4.验证内容
4.1.验证准备
4.1.1样品名称和规格：甲硝唑片规格：0.2g
样品批号：、、
4.1.2 实验用培养基：
4.1.3稀释液：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液
4.1.4检查所涉及的设备：
4.1.5检查所涉及的试验用菌种
4.1.6 验证用培养基、缓冲液应置121℃湿热灭菌15分钟，验证用玻璃仪器应置
163℃干热灭菌2小时。

4.2.菌液制备
表1 试验菌液的制备和使用
按表1 规定程序培养各试验菌株。

取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜液体培养物1ml，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液稀释至浓度约为103～104cfu/ml的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3〜5ml含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液稀释至浓度约为103～104cfu/ml的黑曲霉孢子悬液。

大肠埃希菌液同金黄色葡萄球菌，稀释浓度为102～103cfu/ml。

4.3.供试液制备
取供试品10g，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，用振摇法将其充分混匀，制成浓度为1:10供试液。

4.4.计数方法适用性试验
4.4.1接种和稀释
按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。

(1)试验组取上述制备好的供试液10ml，加入试验菌液0.1ml，混匀，使每1ml
供试液中含菌量不大于100cfu。

(2)供试品对照组取制备好的供试液10ml，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌
液同试验组操作。

(3)菌液对照组取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试液，按试验组操作加入试
验菌液并进行微生物回收试验。

4.4.2抗菌活性的去除或灭活
供试液接种后，按下列“微生物回收”规定的方法进行微生物计数。

若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌落数值的50%。

可采用增加稀释液或培养基体积消除供试品的抑菌活性。

4.4.3供试品中微生物回收
4.4.3.1平皿法：采用倾注法测定，取上述各组样品各1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15〜20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，按表1规定条件，倒置培养、计数。

每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿，以算术均值作为计数结果。

实验结果见表2。

表2 菌落计数（常规法）
4.4.3.1.1结果计算：试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5〜2 范围内。

若各试验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。

表3 菌落回收计算（常规法）
检查人/日期：复核人/日期：
4.5控制菌检查方法的验证：大肠埃希菌
4.5.1使用经过培养基适用性检查的培养基。

4.5.2常规法
4.5.2.1各试验组操作及结果
（1）试验组取供试液10ml及大肠埃希菌液0.1ml，接种至100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30〜35℃培养18〜24小时。

取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42〜44℃培养24〜48小时。

取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30〜35℃培养18〜72小时。

（2）阴性对照组取稀释剂10ml接种至100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，照试验组培养，观察。

试验结果见表6
表6控制菌检查（常规法）
检查人/日期：复核人/日期：
4.5.3培养基稀释法
4.5.3.1各试验组操作及结果
（1）试验组取供试液10ml及大肠埃希菌液0.1ml，接种至1000ml的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30〜35℃培养18〜24小时。

取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42〜44℃培养24〜48小时。

取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30〜35℃培养18〜72小时。

（2）阴性对照组取稀释剂10ml接种至1000ml的胰酪大豆胨液体培养基中，照试验组培养，观察。

试验结果见表7
表7控制菌检查（培养基稀释法）
检查人/日期：复核人/日期：
5偏差及结果评估
验证过程中验证人员及时记录验证过程的数据及现象，验证组长对出现的
偏差及时组织验证人员进行分析讨论，在验证报告中说明。

6验证结论
将验证结果在验证记录中进行记录，验证组长对验证结果进行总结。