PEG 10mRNA 的抑制作用最强,表明靶mRNA 的二级结构对siRNA 的功能有很大影响。
本研究中我们构建针对PEG 10基因的siRNA 真核表达载体,并通过酶切鉴定和测序鉴定,说明我们构建的针对PEG 10的真核表达载体是正确有效的,可以用于后续PEG 10基因功能的研究,以及沉默PEG 10后抑制肝癌细胞生长,诱导肝癌细胞凋亡,从而为肝癌的基因治疗提供理论依据和实验工具。
参考文献:[1] Ryuichi Ono ,Shin K obayashi ,Hirotaka Wagat suma ,et al.Aretrotransposon 2derived gene ,PEG 10,is a novel imprinted gene located on human chromosome 7q 21[J ].Genomics ,2001,73(2):2322237.[2] Noble A ,Towne C ,Chopin L ,et al.Insulin 2like growt h fac 2tor 2Ⅱbound to vitronectin enhances MCF 27breast cancer cellmigration[J ].Endocrinology ,2003,144(6):241722424.[3] Moorehead RA ,Sanchez O H ,Baldwin RM ,et al.Transgenicoverexpression of IGF 2Ⅱindues spontaneous lung tumors :a model for human lung adenocarcinoma [J ].Oncogene ,2003,22(6):8532857.[4] Vella V ,Sciacca L ,Pandini G ,et al.The IGF system in t hy 2roid cancer :new concept s[J ].Mol Pat hol ,2001,54(3):1212124.[5] Tsou AP ,Chuang YC ,Su J Y ,et al.Overexpression of a no 2vel imprinted gene ,PEG 10,in human hepatocellular carcino 2ma and in regenerating mouse livers [J ].J Biomed Sci ,2003,10(6Pt 1):6252635.[6] Hiroshi Okabe ,Seiji Satoh ,Y oichi Furukawa ,et al.Involve 2ment of PEG 10in human hepatocellular carcinogenesis t hrough interaction wit h SIA H 1[J ].Cancer Research ,2003,63(12):304323048.[7] 常莹,陶璐薇,陈孝平,等.肝癌组织中遗传印记基因PEG 10表达的特异性及其意义[J ].世界华人消化杂志,2005,13(12):140821411.[8] Naito Y ,Yamada T ,Ui 2Tei K ,et al.siDirect :highly effec 2tive ,target 2specific siRNA design software for mammalian RNA interference [J ].Nucleic Acids Res ,2004,32:W 1242129.[9] Reynolds A ,Leake D ,Boese Q ,et al.Rational siRNA designfor RNA interference[J ].Nat Biotechnol ,2004,22(3):3262330.[编辑:刘红武]收稿日期:2006202221;修回日期:2006204214基金项目:怀化市科技计划资助项目(0502)作者单位:1.418000湖南怀化医学高等专科学校检验 系;2.中国科学院生物物理研究所结构与分子生物学研究 中心作者简介:张申(1955-),男,学士,教授,主要从事自由 基生物学研究巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶来源的NO 对共培养HL 60细胞凋亡的影响张 申1,尹利华1,卫涛涛2E ffects of Inducible Nitric Oxide Synthase Derived Nitric Oxide on Apoptosis of H L 60Cells Co 2cultured with RAW 264.7MacrophagesZHAN G Shen 1,YIN Li 2hua 1,WEI Tao 2tao 21.De partment of L aboratory Medicine ,H uai hua Medical College ,H uai hua 418000,China;2.Center f or S t ructural and Molecular B iology ,I nstitute of B iophysics ,Chinese A cadem y of SciencesAbstract :Objective To study effects of inducible nitric oxide synthase (iNOS )2derived nitric oxide (NO )on apoptosis of HL 60cells co 2cultured with RAW 264.7macrophages.Methods Upon stimulation withlipopolysaccharide (L PS )and interferon 2γ(IFN 2γ),inducible nitric oxide synthase gene was expressed in RAW 264.7macrophages ,which caused the consequent generation of nitric oxide.Effects of nitric oxide on HL 60cells viability ,expression of bcl 22and bax protein ,activity of Caspase 23and cell apoptosis were evaluated with M T T assay ,Western blot analysis ,fluorescence analysis ,flow cytometry (FCM ),trans 2mission electron microscopy (TEM )and DNA agarose gel electrophoresis.R esults The results showed that iNOS 2derived nitric oxide caused oxidative damage of HL 60cells co 2cultured with RAW 264.7mac 2rophages ,and decreased cell viability ,and evidently reduced expression of bcl 22and increased expression of bax ,and induced activity of caspase 23and DNA f ragmentation.Conclusion The results suggested im 2portant effect of iNOS 2derived nitric oxide on apoptosis of cells in RAW 264.7macrophages.K eyw ords :Induciblenitricoxidesynthase ;Nitric oxide ;Apoptosis ;Mac 2rophage摘 要:目的 研究巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶(iN 2OS )来源的一氧化氮(NO )对共培养HL 60细胞凋亡的影响。
方法 以脂多糖(L PS )和γ2干扰素(IN F 2γ)诱导RAW 264.7巨噬细胞iNOS 基因的表达产生过量NO 为实验模型,通过噻唑蓝(M T T)试验、蛋白质印迹分析、荧光分析、流式细胞术(FCM)、透射电镜和DNA琼脂糖凝胶电泳等分析技术,观察NO对共培养的HL60细胞存活率、bcl22和bax蛋白表达、Caspase23活性和细胞凋亡的影响。
结果 RAW264.7巨噬细胞中iNOS来源的NO对共培养HL60细胞能造成氧化损伤,降低细胞的存活率;bcl22表达明显下降,而bax表达增加;激活Caspase23和促进DNA的降解。
结论 巨噬细胞中iNOS来源的NO在诱导细胞凋亡中发挥重要的作用。
关键词:诱导型一氧化氮合酶;一氧化氮;细胞凋亡;巨噬细胞中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:10002 8578(2007)01200882050 引言巨噬细胞是一种参与机体非特异性免疫防御的重要免疫细胞。
1988年Hibbs首先证明哺乳动物的巨噬细胞能产生NO[1],现已证实,NO是一种具有重要生理、病理功能的内源性生物信息分子,在生物体内,NO由三种不同的一氧化氮合酶(Nit ric ox2 ide synt hase,NOS)催化L2精氨酸而生成,其中可诱导型一氧化氮合酶(Inducible nit ric oxide synt hase, iNOS)是在诱导因素作用下,由巨噬细胞、中性粒细胞、胶质细胞等产生,其活性不受Ca2+浓度的影响,生成NO量大,主要作用是参与炎症反应和免疫细胞对病原体的防御。
但过量的NO可与超氧阴离子(O2・-)迅速反应,生成具有强氧化性的过氧化亚硝基阴离子(ONOO-)[2],ONOO-引起的氧化损伤是NO具有细胞毒性的重要原因之一[3,4]。
本研究以脂多糖(L PS)和γ2干扰素(IN F2γ)诱导RA W264.7细胞iNOS基因的表达产生过量NO为模型,通过M T T试验、蛋白质印迹分析、荧光分析、透射电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳等分析技术,观察NO对共培养的HL60细胞存活率、bcl22和bax蛋白表达、Caspase23活性和细胞凋亡的影响。