实验中医肺岩宁方对肺癌干细胞Wnt 信号通路的影响王爽1王立芳1徐振晔1沙慧芳21．上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科（上海200032）2．上海交通大学附属胸科医院胸部肿瘤研究所（上海200030）【摘要】目的：分离、鉴定肺癌干细胞，并探讨肺岩宁方对肺癌干细胞Wnt 信号通路的干预作用。
方法：分离、鉴定肺癌干细胞；将分离出的SP +肺癌干细胞分为对照组（空白血清+生理盐水）、单纯化疗（空白血清+DDP 组）、肺岩宁方组（肺岩宁方含药血清+生理盐水）、综合治疗组（肺岩宁方含药血清+DDP ），予体外药物干预后检测β-catenin 蛋白表达及SP +肺癌干细胞凋亡情况。
结果：分离的SP +、CD24+IGF-1R +、CD133+细胞具有肺癌干细胞特性，分离的β-catenin 蛋白完整；综合治疗组诱导SP +干细胞凋亡优于其他组，各组凋亡率分别为综合治疗组79．2%、肺岩宁方组21．3%、DDP 组33．7%、对照组0．3%。
结论：本课题组已掌握分离、鉴定肺癌干细胞的技术，中药肺岩宁方联合化疗具有一定的诱导肺癌干细胞凋亡的作用。
【关键词】肺岩宁方；肺癌干细胞；Wnt 信号通路；β-连环蛋白【中图分类号】R285．5；R734．2【文献标志码】A 【文章编号】1008-861X （2012）06-0077-06［基金项目］国家自然科学基金资助项目（30973822）［作者简介］王爽，女，在读博士生，主要从事中医药抗肿瘤临床及基础研究。
［通讯作者］徐振晔，教授，博士生导师。
E-mail ：xuzhenye1947@126．com自从Bonnet 等［1］于1997年第一次发现白血病干细胞，并证实其具有自我更新、增殖、分化功能以来，肿瘤干细胞的作用不断被认识，而且它的存在可能导致肿瘤细胞增殖的加速［2］，是肿瘤形成、生长、转移和复发的根源［3-7］。
随着研究的深入，人们已经意识到肺癌可能是一种干细胞疾病，具有自我更新和无限增殖能力的肺癌干细胞是肺癌发生的“根源”，肺癌的复发、侵袭转移、耐药、抗辐射等恶性表型特征都与肺癌干细胞有关。
因此，针对肺癌干细胞的治疗［8-9］可能效果更持久，同时能阻止肿瘤的复发、转移，这对于肺癌的治疗有深远的意义。
中医理论认为，肿瘤的发生、发展是由于机体正气亏损，导致邪毒凝聚、阴阳失衡的病理变化，肿瘤侵袭转移的根本原因在于肾精亏虚、阴阳失衡，临床上中晚期肺癌患者常具有精气两亏之证候，而扶助肾中精气结合解毒散结法抗癌的确具有良效。
据此徐振晔教授研制出具有益气养精、解毒散结之功的肺岩宁方。
前期临床研究表明该方联合化疗具有良好的治疗进展期非小细胞肺癌的作用［10］，实验研究表明该方具有干预细胞周期G1/S 检测点调控信号抗Lewis 肺癌细胞增殖的作用［11］。
本研究旨在前期研究基础上，首先对肺癌干细胞进行分离、鉴定，并初步探讨肺岩宁方对肺癌干细胞的干预作用，为肺岩宁方干预肺癌干细胞的进一步研究奠定基础。
1材料与方法1．1实验材料1．1．1实验动物BALB /C 裸鼠，雄性，体质量（20ʃ2）g ，购自中国科学院上海实验动物中心，动物合格证号：SCXK （沪）2007-0005，饲养于上海中医药大学附属龙华医院SPF 级动物房。
雄性Wistar大鼠18只，清洁级，体质量为（200ʃ15）g ，合格证号：SCXK （沪）2007-0001。
1．1．2药品与试剂肺岩宁方，由生黄芪、黄精、仙灵脾、重楼、山慈菇等组成，龙华医院中药房提供。
常规水煎，水浴浓缩至生药含量为2．0g /ml ，4ħ保存备用。
顺铂（DDP ），齐鲁制药厂（批号：95062015），临用时注射用水配制成0．1mg /ml 水溶液。
胎牛血清（FBS ）、F12k 培养基，Gibco 公司产品；荧光染料Hoechst33342，Sigma 公司产品；0．25%胰酶，Gibco 公司产品；纤维细胞生长因子（FGF ）、重组人表皮生长因子（EGF ），购自Sigma 公司。
1．1．3肺癌细胞A549人肺腺癌细胞株，购自中国科学院上海生命细胞库，在含10%FBS 的F12k 培养基中传代培养，取活跃增殖期细胞进行实验。
1．2肺癌干细胞分离及鉴定实验1．2．1流式细胞仪分离SP +肺癌干细胞取对数期生长的A549细胞，0．25%胰酶消化，按照试剂说明书及流式细胞仪操作指南，分选出SP 细胞及Non SP 细胞，其中SP 细胞分别用于接种裸鼠及体外增殖实验。
1．2．2免疫磁珠分离CD24+IGF-1R +、CD133+肺癌干细胞取对数期生长的A549细胞，0．25%胰酶消化，分别按照操作指南用MiniMACS分离柱分选，并收集得到的CD24+IGF-1R+、CD133+细胞，用于接种裸鼠及体外增殖实验。
1．2．3体内致瘤性观察收集分离得到的肺癌细胞，SP+细胞浓度设为1ˑ103、5ˑ103、5ˑ104个，CD24+IGF-1R+与CD133+细胞浓度均分别设为100、500、2000个。
分别将不同浓度的肺癌细胞接种于4周龄裸鼠左腋下，10只/组；同时以1ˑ107个A549细胞接种，作为阴性对照。
接种后每天观察一次肿瘤生长情况。
取第2周、第4周，分别统计肿瘤形成情况；于观察第4周，将小鼠断颈处死，拍照后摘取肿瘤，测量后用于检测。
1．2．4“成球”能力观察收集分离得到的SP+、CD24+IGF-1R+、CD133+细胞，用含20ng/ml重组人酸性成纤维细胞生长因子（FGF）、20ng/ml重组人表皮生长因子（EGF）、20%FBS的F12接种于24孔培养板，于37ħ5%CO2培养箱中培养，每天于显微镜下观察，直到形成“肿瘤球”。
同条件下培养A549细胞作为阴性对照。
1．2．5免疫荧光检测肿瘤组织将裸鼠处死，剖取肿瘤，在10%福尔马林溶液中进行固定。
肿瘤组织经脱水、透明后用石蜡包埋，将包埋好的组织进行切片，切片厚度为5μm。
切片常规脱蜡至水，按照免疫荧光检测步骤及试剂盒说明书操作染色，CD24+ IGF-1R+细胞抗体为Rabbit Anti-human CD24单克隆抗体（FITC标记，1ʒ200稀释，稀释液为含1% BSA PBST）、Rat Anti-human IGF-1R单克隆抗体（TRITC标记，1ʒ500稀释），CD133+细胞抗体为Rabbit Anti-human CD133单克隆抗体（TRITC标记，1ʒ250稀释，稀释液为含1%BSA PBST），染色后在共聚焦显微镜下观察并拍照（400倍）。
1．3肺岩宁方含药血清制备及干预1．3．1含药血清制备将雄性Wistar大鼠按体质量每日灌胃给予中药药液（1．5ml/kg），连续给药3d，于最后1次给药1h后（灌药前12h禁食），乙醚麻醉，腹主动脉采血，室温放置待血凝之后，5000r/min，离心7min。
将血清过滤除菌，56ħ灭活30min，密封，－20ħ保存备用。
1．3．2体外实验将分离出的SP+肺癌干细胞分为对照组（模拟用药）、DDP组（单纯化疗）、肺岩宁方组（单纯中药）、综合治疗组（中药+化疗），第3天给药后2h取材进行检测。
给药方法如下：①对照组：空白血清+生理盐水；②DDP组：空白血清+ DDP；③肺岩宁方组：肺岩宁方含药血清+生理盐水；④综合治疗组：肺岩宁方含药血清+DDP。
均每日1次。
1．4检测指标与方法1．4．1Western blot法检测β-catenin蛋白按照试剂盒说明提取总蛋白，然后加入抽提试剂去除非蛋白成分，离心、干燥，得到总蛋白，BCA方法检测蛋白浓度。
取等量蛋白样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，按照湿法电转印方法操作，电转电压100V，恒压，最后用ECL化学发光法显色，以CAPDH作为对照。
1．4．2流式细胞仪法检测肺癌干细胞凋亡取用药干预后的肺癌干细胞，0．25%胰酶消化，按照试剂说明书及流式细胞仪操作指南，采用annexin v/PI 双染法检测肺癌干细胞凋亡率。
1．5统计学方法采用SPSS18．0统计软件，对实验数据进行分析，计数资料使用卡方检验，计量资料采用方差分析。
2结果2．1致瘤性分析2．1．1SP+肺癌干细胞至观察第2周，除A549细胞株外，不同浓度的SP+肺癌干细胞均有肿瘤形成；第4周，除A549细胞株外，各浓度的SP+肺癌干细胞均致裸鼠形成肿瘤。
结果表明，接种时细胞浓度越大则第2周形成肿瘤的比例越高，第4周形成的肿瘤越大，即仅需要103个SP+肺癌干细胞便可在较短时间内导致肿瘤的发生，并且其致瘤性呈浓度正相关。
见表1。
表1SP+肺癌干细胞致瘤性分析细胞浓度（个）肿瘤形成比肿瘤大小（g）1ˑ1033/101．23ʃ0．055ˑ1038/101．64ʃ0．055ˑ10410/102．05ʃ0．05 2．1．2CD24+IGF-1R+及CD133+肺癌干细胞第2周，除A549细胞株外，不同浓度的CD24+IGF-1R+及CD133+肺癌干细胞均有肿瘤形成；第4周，除A549细胞株外，各浓度的CD24+IGF-1R+及CD133+肺癌干细胞均致裸鼠形成肿瘤。
结果表明，其致瘤性呈浓度正相关。
见表2，图1、图2。
表2CD24+IGF-1R+及CD133+肺癌干细胞致瘤性分析细胞浓度（个）CD24+IGF-1R+肿瘤形成比肿瘤大小（g）CD133+肿瘤形成比肿瘤大小（g）1005/101．53ʃ0．044/101．04ʃ0．085006/102．03ʃ0．057/101．78ʃ0．02200010/102．27ʃ0．0710/102．17ʃ0．02图2CD24+IGF-1R +肺癌干细胞形成肿瘤的组织免疫荧光检测（DAPI 染核，FITC 染膜和TRITC 染膜）2．2“成球”能力监测2．2．1SP +肺癌干细胞除A549细胞株外，3种不同浓度SP +肺癌干细胞于培养后5 10d 内均形成“肿瘤球”，但其所需时间并不相同，高浓度“成球”所需时间最短、“肿瘤球”直径最大。
见表3，图3。
表3不同浓度SP +肺癌干细胞“成球”时间及“肿瘤球”直径细胞浓度（个）成球时间（d ）球径（μm ）1ˑ1039605ˑ1038905ˑ1044250图3SP +肺癌干细胞体外增殖形成的肿瘤球（ˑ400）2．2．2CD24+IGF-1R +及CD133+肺癌干细胞除A549细胞株外，不同浓度CD24+IGF-1R +及CD133+肺癌干细胞，于培养后5 10d 内均形成“肿瘤球”，但其所需时间并不相同，高浓度“成球”所需时间最短、“肿瘤球”直径最大。
见表4，图4、图5。
表4不同浓度CD24+IGF-1R +及CD133+肺癌干细胞“成球”时间及“肿瘤球”直径细胞浓度（个）CD24+IGF-1R +形成球时间（d ）球径（μm ）CD133+成球时间（d ）球径（μm ）1001080105050071207100200052305200图4CD24+IGF-1R +肺癌干细胞体外增殖形成的肿瘤球（ˑ400）图5CD133+肺癌干细胞体外增殖形成的肿瘤球（ˑ400）2．3对β-catenin蛋白的影响Western blot法检测结果显示，分离的β-catenin蛋白完整。