f=20kb/3×109
n=690773.2
E.coli 4639221bp p=99% f=20kb/4600kb n=1056.9
p=99% f=10kb/4600kb n=2116
的外源 DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的 特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA 经反转录形成的cDNA，它们所构成的重ribosomal RNAs and the genes encoding them was introduced to describe uncultured bacteria in the environment.
°根据密码子的使用频率, 合成猜测体探针
° 设计两组简并探针, 用第二个探针对第一次筛 选的阳性克隆子作第二次杂交
• 综合合成
可能的话 设计一对, 用PCR产物作探针
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三、免疫
在可获得PT后, 制备抗体, 用于筛选
四、高表达基因
高丰度mRNA, 如 用苯肼作了贫血处理的兔网织 红细胞中,血红蛋白mRNA的含量占绝大多数
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见筛选工具: 探针
狭义: 核酸, 抗体 广义: 还包括其他筛选手段
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一、功能筛选
利用目标基因的特定功能进行筛选
• 抗性基因: antibiotics抗性基因, 抗重金属活 性
• 分解基因: 苯环化合物, 分解酶
• 功能活性：杀虫675-6758
精选课件ppt1什么是？Library 基因（也称DNA）是指某一生物体全部或部分基因的集合，
就像一个没有目录的“基因图书馆” 基因的组成：外源DNA片段：研究对象基因组DNA或cDNA 载体：质粒载体（plasmid）、黏粒载体（cosmid）、人工染色体 （BAC、YAC）等 宿主：大肠杆菌（E.coli）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）
精选课件teria in pure culture is typically the first step in investigating bacterial processes.
➢ standard culturing techniques account for 1% or less of the bacterial diversity in most environmental samples
➢ a suite of culture-independent techniques are
needed to complement efforts to culture the
thousands or millions of unknown species in the
精选课件ppt19什么是宏基因组？精选课件ppt15
五(1)、差别杂交
五(2)、扣除杂交 六、mRNA差别显示
Differential display PCR, DD PCR
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七、酵母双杂交系统
用于分离与某一已知蛋白发生相互作用的 蛋白质基因
GAL4蛋游激活区(UAS)可启动gal基因的转录
GAL4蛋白：可分为两个区域 DNA-BD: DNA结合域, N-末端 1-147aa AD: 转录激活域， C-末端 768-881aa
精选课件经纯化后部 分酶切，然后把这些DNA片段连接到载体 上胞获得的新功能进行筛选, 或用 相关已知序列设计探针或PCR引物寻找并 分离目的基因片段，加上表达调控元件后 使目的基因表达，从而获得产物。
• 功能缺失
在获得相应突变体的前提下 以此突变体作为宿主 在野生型的DNA导入后检测回复突变
如 营养缺陷型 相关的基因
二、核酸探针 • 同源DNA探针
高度保守的基因 rRNA基因 邻近种属的相应基因
相应基因
蛋白质N-末端aa序列
简并探针degeneracy 选取简并程度低的aa序列
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载体的选择：
可装载的外源DNA
Plasmid
λ Phage Cosmid BAC YAC
<10kb
0-23kb ~45kb ~ 100kb ~ 300kb-1.2Mb
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粘粒克隆所需的克隆子数是λ phage的一半， 如λ 需700000时，cosmid需350000个
如无特殊需要(如单个λ phage不能包容靶基因片段 或要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克 隆时)一般不采用cosmid，因其在构建和贮存 比λ phage困难得多
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YAC可用于克隆500kb以上，甚至几Mb的DNA片段 BAC 可减少DNA分子间的重组
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Vector
Amp ori
MCS
Tet gene without promoter
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在Tet 平板上筛选抗性菌落, 可得到promoter
其他标记: gfp, Kan
质粒复制单位的克隆
Amp ori
MCS
目标宿主可用的 抗性gene
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在抗性平板上筛选抗性菌落, 可得到质粒复制单位
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1976年L.Clark,p)/基因组DNA大小的比值
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哺乳动物 3×109kb 若p=99% 平均克隆片段20kb