张龙翔等在对胰蛋白酶结构与功能研究的基础上, 在国内最早提出蛋白质工程研究的设 计与构想。其后我们陆续开展了金属硫蛋白、胰岛素和抗凝溶栓剂等的蛋白质工程研究, 进一 步揭示了这些蛋白质结构与功能的关系, 获得了一系列有开发应用价值的蛋白质突变体。有关 研究结果分别报道如下。
1 胰蛋白酶的蛋白质工程
我们早期开展的蛋白质结构与功能的研究工作, 选择了胰蛋白酶自溶作用为对象, 研究猪 胰蛋白酶在有限度的自溶过程中化学结构的变化及其对酶活性的影响。胰蛋白酶属于丝氨酸 蛋白酶类, 是一条具有223个氨基酸残基和以异亮氨酸为 N 末端的单肽链。胰蛋白酶即使在温 和的条件下, 也很容易发生自溶作用。在60年代中期, 我们曾从猪胰蛋白酶的自溶产物中应用 离子交换纤维素柱层析和葡聚糖凝胶过滤分离出几个具有酶活性的蛋白峰。由于工作的中断, 对于这些活性产物未作进一步的鉴定。1978年后, 又重新开展了这一研究, 发现猪胰蛋白酶虽 比牛胰蛋白酶较为稳定, 但还是很容易发生自溶作用。自溶产物经层析分离, 得到4个组分具有 胰蛋 白酶 活性, N 末端 基分析 表明在 这些 活性产 物中, Ar g117-Val118, Lys145-Ser146, 及
2. 328
0. 562
0. 467
0. 358
野生型鼠胰蛋白酶
0. 424
0. 303
0. 145
6. 1×10- 3
突变体 R62D
0. 312
—
99. 6×10- 3 —
突变体 K97E
0. 15×10- 3
1. 7×10- 3
—
—
突变体 K175E
酶
天然酶 缺失突变体 R117E R117L R117M R117C
Km
/ LmolõL- 1 24. 08 16. 60 2. 67 4. 52 8. 32 —
K cat
/ s- 1 12. 34 11. 11
0. 056 74. 04
6. 01 —
Kca t/ Km
/ Lõ( s õLmol) - 1 0. 51 0. 67 0. 021
16. 38 0. 72 —
相对
活性 1 1. 31 0. 041
31. 97 1. 41 0
半衰期
10. 5 13. 5 12. 5 12. 5
8. 0 —
可见, 大部分突变体的稳定性有所提高, 与预想结果相符, Arg117Cys 突变体没有活性[7], 而 Arg117 Leu 的活性比野生型提高了31倍。
2. 2 A-A 结构域突变体结构与功能的研究
分别用 PCR 和限制性内 切酶酶切的方法获得两段小鼠 MT-Ⅰ A-结 构域的基因, 并与 pGEX-4T-1融合表达载体连接、表达, 经过超声破碎、Glutat hione Sepharose 4B 亲和层析、凝 血酶酶切以及 Sephadex G50分子筛纯化等步骤, 最后得到了突变体蛋白。突变体蛋白的产率 约为每 L 培养基3～4 mg 蛋白。脱金属后突变体蛋白的分子量、氨基酸组成分析和 N 端部分 氨基酸序列测定结果均与预期值相符, 二价金属与各突变体蛋白的结合比率也为预期的8÷1左 右, Cd 和 Zn 从 A-A结构域突变体蛋白上的半解离 pH 值与天然兔肝 MT 和表达的小鼠 MT 都非常相近, 表明这些突变体蛋白仍具有金属硫蛋白的特征。在不同 pH 时分别对这3种 Cd 饱 和的 A-A结构域突变体蛋白进行了紫外扫描光谱和圆二色谱( CD) 的测定。各突变体蛋白的紫 外吸收谱线与小鼠 MT-I 是基本一致的, 即在 pH 8. 0时, 所有的 Cd 结合蛋白都在250 nm 处呈 现较高的吸收值; 当 pH 降至2. 0时, 由于金属从蛋白上的解离, 这一吸收肩完全消失。在 CD 谱中, 258 处的峰同样表示 结合簇, 并且随 降至2. 0而消失; 其中258 处的峰为 -
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ0 引 言
生物技术的兴起使得分子生物学的理论与工程实践紧密结合。70年代初, DNA 重组技术 诞生[ 1] , 并成功地用于基因操作, 从而产生了基因工程[ 2] 。80年代初, 产生了蛋白质工程[ 3] , 即 通过对蛋白质已知结构和功能的了解, 借助计算机辅助设计, 利用基因定位诱变等技术改造基 因, 以达到改进蛋白质某些性质的目的。蛋白质工程的出现, 为认识和改造蛋白质分子提供了 强有力的手段[ 4] 。
2. 1 单一 MT 结构域结构与功能的研究
同时用蛋白酶水解和大肠杆菌表达两种方法获得了单一的 MT 结构域。前者是将提取的 天然 MT 蛋白脱去金属后, 再根据不同结构域对不同金属的亲和性不同, 在脱金属 MT 中加 入一定量的金属离子部分饱和蛋白, 然后用枯草杆菌蛋白酶酶切, Sephadex G75层析纯化得 到单一的结构域[ 12] 。大肠杆菌表达则是将 A-结构域基因插入表达载体 pGEX-4T -1中表达成 融合蛋白[ 13] , 再经亲和层析、凝血酶酶切及分子筛层析等方法获得 A-结构域蛋白。这些结构域 的氨基酸组成、分子量、金属结合比率等结果与预期基本是一致的。另外, 测定了它们的紫外吸 收光谱和圆二色谱, 也具有与天然 MT 相似的特征, 用原子力显微镜可以观察到球状结构。所 有结果表明, 两种方法得到的单一结构域均能独立形成以金属-巯基结合簇为中心的结构, 并 具有与完整的天然 MT 相似的金属结合特征。
DOI：10.13209/j.0479-8023.1998.109
北京大学学报( 自然科学版) , 第 34 卷, 第 2-3 期, 1998 年 4 月 Act a Scientiar um Nat ur alium Universit atis Pekinensis, Vol. 34, No. 2- 3 ( Apr , 1998)
表2 胰蛋白酶及其突变体的 Kcat/ Km Table 2 K cat/ Km values of tr ypsin and it s mutants
Lõ( sõmmol) - 1
胰蛋白酶种类
pH6. 85
TA ME 底物
TL ME 底物
pH8. 85
T AME 底物
T LME 底物
脏器提取牛胰蛋白酶*
此外, 我们还进行了精氨酸底物专一性的改造, 通过将酶分子表面的正电荷改变成负电
荷, 以提高催化基团 His57的 pKa 值, 从而在 pH 较高的条件下显示出对精氨酸更高的专一
性。我们选择了 Arg 62 Asp, Lys 97 Glu 及 Lys 175 Gl u 作为研究目标, 进行了组合突变得到了 如表2所示的结果。
此外, 我们还进行了胰蛋白酶特异二硫键的研究。与同源的胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶相 比, 胰蛋白酶具有( 22, 157) 和( 129, 232) 两对特异性二硫键。对( 22, 157) 这对二硫键定位改造 的结果表明: Cys 22 Ser 失去胰蛋白酶活性, 而 Cys157 Ser 和 Cys 22 Ser/ Cys157 Ser 均保持了 酶活性。对( 129, 232) 这一对二硫键进行定位改造, 也得到了相似的结果。 232 丧失了
第 2-3 期 唐建国等: 蛋白质工程的研究 34 5
结 构域的 Cd 结 合簇, 而220nm 左右 的小 峰则 归因 于 MT 的 B-结构 域。用原 子力 显微 镜 ( AF M) 观测其中一个 A-A结构域突变体的构象, 与小鼠 MT -I 类似, 可以看到两个相连的大小 相等的球状结构。所有这些结果都证明了即使没有 B-结构域的存在, A-A结构域突变体也能够 独立形成两个以金属-巯基结合簇为中心的球形结构。各突变体蛋白与不同金属结合的亲和性 不同, 对于 Cd 的亲和性大小的顺序是 A-KKS-A> A-SKKS-A> A-GKKST -A> 小鼠 MT -I; 而对 于 Zn, 仅 A-KKS-A具有比小鼠 MT-I 更强的亲和性。这说明不同的连接区对于蛋白与金属的 结合能力有一定的影响; 连接区越长, 蛋白的金属结合能力就越弱, 而天然金属硫蛋白的连接 区在这些突变体中仍然是最佳选择。这些突变体蛋白对于自由基的拮抗能力为: A-SKKS-A> A-KKS-A> A-GKKST -A> 小鼠 MT-I, 即所有突变体蛋白都具有比天然 MT 更强的拮抗自由 基能力。这一结果也说明 MT 抗自由基的活性中心可能存在于 A-结构域, 但这需要更深入的 实验来证明。以上所有结果表明, 用分子剪裁的方法所得到的 A-A突变体蛋白均具有与天然金 属硫蛋白类似的结构和功能, 证实了 A-结构域的独立性, 同时也说明两个结构域之间的连接 区对于整个蛋白分子的功能行使起着相当重要的作用。通过体外实验筛选出一种具有比天然 MT 分子更强生物功能的突变体: A-KKS-A, 并将其基因转入植物, 以应用于环保工作, 如检测 或清除重金属污染等等。
3 44 北京大学学报( 自然科学版) 百年校庆 纪念专刊 第 34 卷
胰蛋白酶活性, 而 Cys129 Ser 和 Cys129 Ser/ Cys 232 Ser 均保留了酶活性[8]。进一步的研究正 在进行中。
2 金属硫蛋白的蛋白质工程
金属硫蛋白( Met allot hionein, MT ) 是一类富含半胱氨酸的小分子蛋白质, 其61个氨基酸 中含有20个半胱氨酸, 可以通过巯基结合大量金属元素。它在自然界广泛存在, 在体内微量金 属元素的运输、储存及代谢, 重金属解毒、拮抗自由基和电离辐射等方面起着重要的作用。MT 一般由两个大小相近、结构和功能类似的结构域组成: A-结构域( 4个二价金属和11个 Cys) 和 B-结构域( 3个二价金属和9个 Cys) , 并由连接区的一段小肽( KKS) 连接。以往的实验结果表 明, 这两个结构域对于不同的金属具有各自独立的亲和能力[9] 。为研究其中单一结构域的结构 和功能的独立性, 同时也为获得一种结构稳定, 并具有比天然 MT 更高的金属结合能力的突 变体, 我们进行了以下几方面的工作: ( 1) 分别用蛋白酶水解天然 MT 和大肠杆菌表达的方法 获得单一的结构域, 并研究其结构与功能; ( 2) 用基因工程的方法构建了3个具有不同的连接 区的 A-A结构域突变体, 即 A-KKS-A( 以天然连接区连接) 、A-SKKS-A和 A-GKKST -A, 并研究 其结构与功能; ( 3) 将单一 A-结构域和多拷贝 A-结构域( A12) 基因转入植物, 研究转基因植株对 重金属抗性的提高[ 10, 11] 。