关键步骤
转膜 是指将核酸分子固定在纤维膜上的过程.将 是指将核酸分子固定在纤维膜上的过程. 核酸从电泳后的凝胶中转移到膜上或直接将 核酸点到膜上. 核酸点到膜上.是核酸杂交过程中的主要步 骤之一. 骤之一.
探针标记
标记方法:缺口平移,末端标记, 标记方法:缺口平移,末端标记,随机引物延 聚合酶链反应等. 伸,聚合酶链反应等. 核酸探针的种类:DNA探针 cDNA探针 RNA探 探针, 探针, 核酸探针的种类:DNA探针,cDNA探针,RNA探 针,寡核酸探针. 寡核酸探针. 选择标记方法: 选择标记方法:一般认为放射性探针比非放射 性探针的灵敏度高.在检测单拷贝基因序列时, 性探针的灵敏度高.在检测单拷贝基因序列时,应 选用标记效率高,显示灵敏的探针标记方法. 选用标记效率高,显示灵敏的探针标记方法. 在对灵敏要求不高时, 在对灵敏要求不高时,可采用生物素探针技术
点杂交( 点杂交(Dot blot) )
将被检测标本点到膜上,烘烤固定.这种方法耗时短, 将被检测标本点到膜上,烘烤固定.这种方法耗时短, 可做半定量分析,一张膜上可同时检测多个样品. 可做半定量分析,一张膜上可同时检测多个样品.为使点样 准确方便,市售有多种多管吸印仪(manifolds),如 ),如 准确方便,市售有多种多管吸印仪( ), Minifold I和II,Bio-Dot (Bio–Rad )和Hybri–Dot,它们有许 和 , 和 它们有许 多孔,样品加到孔中, 多孔,样品加到孔中,在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭 缝状,取出膜烤干或紫外线照射以固定标本, 缝状,取出膜烤干或紫外线照射以固定标本,这时的膜就可 以进行杂交. 以进行杂交.
分子生物学研究方法
重组DNA技术发展史上的重大事件 一, 重组 技术发展史上的重大事件
三大理论基础:
1. 40年代确定了遗传信息的携带者,即基因的分子载体是DNA而不 是蛋白质,解决了遗传的物质基础问题; 2. 50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决 了基因的自我复制和世代交替问题; 3. 50年代末至60年代,相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地 破译了遗传密码,充分认识了遗传信息的流动和表达.
70年代末期到80 年代早期, 70 年代末期到80年代早期 , 分子生物学技术有了突破 年代末期到 80年代早期 性进展,限制性内切酶,载体系统的发展和应用. 性进展,限制性内切酶,载体系统的发展和应用. 固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生, 固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生 , 现在可常规 制 备 18 ～ 100 个 碱 基 的 寡 核 苷 酸 探 针 . 应 用 限 制 酶 和 Southern印迹技术, 用数微克DNA就可分析特异基因, DNA就可分析特异基因 Southern 印迹技术,用数微克 DNA 就可分析特异基因 , 大 印迹技术 大提高了杂交水平和可信度. 大提高了杂交水平和可信度.
由于DNA一般都以双链形式存在, 由于DNA一般都以双链形式存在,因此在 DNA一般都以双链形式存在 进行分子杂交时,应先将双链DNA分子解聚成 进行分子杂交时,应先将双链DNA分子解聚成 DNA 为单链,这一过程称为变性, 为单链,这一过程称为变性,一般通过加热 或提高pH值来实现. 或提高pH值来实现. pH值来实现
菌落原位杂交( 菌落原位杂交(Colony in situ hybridization) ) 菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移 到硝酸纤维素滤膜上, 到硝酸纤维素滤膜上,然后将滤膜上的菌落 裂菌以释出DNA.将DNA烘干固定于膜上 . 裂菌以释出 烘干固定于膜上 标记的探针杂交, 标记的探针杂交 与32P标记的探针杂交,放射自显影检测菌 落杂交信号,并与平板上的菌落对位. 落杂交信号,并与平板上的菌落对位.
Northern印迹杂交( blot) Northern印迹杂交(Northern blot) 印迹杂交
将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜方法. RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜方法. 从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜方法 DNA印迹技术由Southern 1975年创建 称为Southern 年创建, Southern印迹 DNA 印迹技术由Southern于 1975 年创建 , 称为 Southern 印迹 印迹技术由 Southern于 技术.RNA印迹技术正好与DNA相对应 故被趣称为Northern 印迹技术正好与DNA相对应, 技术.RNA印迹技术正好与DNA相对应,故被趣称为Northern 印迹杂交,与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为 Western blot. blot. Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印 印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印 方法类似, 只是在进样前用甲基氧化汞, 方法类似 , 只是在进样前用甲基氧化汞 , 乙二醛或甲醛使 RNA变性 , 而不用NaOH 因为它会水解RNA NaOH, RNA的 - 羟基基团. RNA 变性, 而不用 NaOH , 因为它会水解 RNA 的 2'-羟基基团 . 变性 RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合以及保 RNA 变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合以及保 持其单链状态. 持其单链状态. 不同之处: 不同之处:没有酶切
核酸杂交反应首先经过凝胶电泳分离的DNA或RNA 分子,然后通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶 中的位置原封不动地"吸印" 转移到滤膜上的. 常用的滤膜有尼龙滤膜,硝酸纤维素滤膜和二乙氨 基乙基纤维素滤膜(DEAE)等.
将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标 记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交. 核酸杂交也称印迹杂交.
基因工程的主要内容或步骤:
1. 从生物有机体基因组中,分离出带有目的基因的DNA片段. 2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记 号的载体分子上,形成重组DNA分子. 3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞)并与之一起 增殖. 4. 从大量的细胞繁殖群体中,筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞, 并筛选出已经得到扩增的目的基因. 5. 将目的基因克隆到表达载体上,导入寄主细胞,使之在新的遗传背景 下实现功能表达,产生出所需物质.
在凝胶电泳中,一般加入溴化乙锭(EB)-ethidium bromide染色,此时,核酸分子在紫外 光下发出荧光,肉眼能看到约50ng DNA所形成的 条带.
2. 核酸的分子杂交技术
核酸杂交技术从Hall 等 1961年的工作开 核酸杂交技术从 Hall等 1961 年的工作开 Hall 始的, 探针与靶序列在溶液中杂交, 始的 , 探针与靶序列在溶液中杂交 , 通过平 衡密度梯度离心分离杂交体. 该法很慢, 衡密度梯度离心分离杂交体 . 该法很慢 , 费 力且不精确, 力且不精确 , 但它开拓了核酸杂交技术的研 究. 60年代中期 Nygaard 60 年代中期Nygaard 等的研究为应用标 年代中期 DNA或 RNA探针检测固定在硝酸纤维素 NC) 探针检测固定在硝酸纤维素( 记 DNA 或 RNA 探针检测固定在硝酸纤维素 ( NC ) 膜上的DNA序列奠定了基础. 膜上的DNA序列奠定了基础. DNA序列奠定了基础
Southern印迹杂交( blot) Southern印迹杂交( Southern blot) 印迹杂交
是研究DNA图谱的基本技术, DNA图谱的基本技术 Southern blot 是研究DNA图谱的基本技术,在 遗传诊断DNA图谱分析,特定基因组的分析及PCR产 遗传诊断DNA图谱分析,特定基因组的分析及PCR产 DNA图谱分析 PCR 物分析等方面有重要价值. 物分析等方面有重要价值.
二, 基因操作的主要技术原理
1. 核酸的凝胶电泳(Agarose) 2. 核酸的分子杂交技术 3. 细菌的转化 4. DNA序列分析 5. 基因的定点诱变(site-directed mutagenesis) 6. 利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究
1. 核酸的凝胶电泳
将某种分子放到特定的电场中,它就会以一定的速度向适当的电极 移动.某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率,它与电场强度 成正比,与该分子所携带的净电荷数成正比,而与分子的摩擦系数成反 比(分子大小,极性,介质的粘度系数等). 在生理条件下,核酸分子中的磷酸基团 磷酸基团是离子化的,所以,DNA和 磷酸基团 RNA实际上呈多聚阴离子状态(Polyanions).将DNA,RNA放到电 场中,它就会由负极→正极移动 杂交的方法:
菌落原位杂交(Colony in situ hybridization) 菌落原位杂交( ) 点杂交( 点杂交(Dot blot) ) Southern印迹杂交( Southern印迹杂交( Southern blot ) 印迹杂交 Northern印迹杂交(Northern blot) 印迹杂交( 印迹杂交 ) 组织原位杂交(Tissue in situ hybridization)等. 组织原位杂交( )
1981R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠; 1983 获得第一例转基因植物. 1994第一批基因工程西红柿在美国上市. 1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊. 2003年人类基因组计划完成,中国1%,
基因工程中常见的名词: 遗传工程--genetic engineering 基因操作--gone manipulation 基因克隆--gone cloning 重组DNA技术--recombinant DNA technology 分子克隆--molecular cloning.
三大技术支持
1970 H.O.Smith,K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了限制性核酸内切酶. H.Boyer,P.Berg等人发展了DNA重组技术,于72年获得