枯草芽孢杆菌的介绍完成者：河岸hkfced（/hkfced）完成时间：2012-3-23版本：第二版本目录第一章芽孢杆菌的简要介绍 (1)第一节芽孢杆菌种类 (1)第二节芽孢杆菌的表达系统发展简史 (2)第二章枯草芽孢杆菌的转化系统 (3)第一节：常见转化方法 (3)1 化学转化法 (3)2 电转化 (3)3 原生质体转化 (3)4 碱金属离子转化 (4)5 质粒的其它转移方式 (4)第二节：标准操作 (4)第一种方法：电转化 (4)第二种方法：Spizizen转化 (5)第三种方法：原生质体法(Takashi) (5)第四种方法：原生质体转化之二 (6)第五种转化方法：质粒混合法（BGSC推荐） (7)第三章芽孢杆菌的表达系统 (8)第一节芽孢杆菌表达系统的优点（相对于大肠杆菌） (8)第二节芽孢杆菌的缺点 (9)第三节助表达系统 (9)第四节芽孢杆菌基因表达的主要特点 (9)第四章枯草芽孢杆菌的转录翻译系统 (9)第一节：转录系统 (10)第二节：翻译系统 (11)第五章芽孢杆菌常用的宿主和载体 (12)第六章芽孢杆菌应用实例 (13)1 中国 (13)2 日本 (13)3 加拿大 (14)第七章芽孢杆菌的产品 (14)第一节核苷类产品 (14)第二节核黄素 (14)第三节微生物制剂/益生菌 (15)第四节工业酶制剂 (15)第八章结语 (15)附录一. 芽孢杆菌的相关经典文章 (16)附录二. 枯草芽孢杆菌相关数据库 (16)致谢及参考文献 (17)第一章芽孢杆菌的简要介绍芽孢杆菌作为一个属，于1872年被首次提出，至今已有一百多年。
目前人们对芽孢杆菌的研究几乎涉及到了革兰氏阳性可生孢细菌的各个领域。
尤其是在感受态、芽孢形成及其调控、遗传操作、菌种改良、生物技术等领域进行了大量的工作。
芽孢杆菌是一个泛泛的概念，而科学研究中应用最多的当属枯草芽孢杆菌，例如168菌株及其大量的衍生菌株。
枯草杆菌的研究之所以领先于其他芽孢杆菌的种，主要是由于他的转化、转导方法较完善，以及大量的衍生菌株。
目前应用最多的芽孢杆菌属菌种有枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和耐碱的芽孢杆菌以及病原菌炭疽芽孢杆菌等12种。
第一节芽孢杆菌种类目前，芽孢杆菌属很多菌株的全基因组序列已经报道，截至2011年10月（目前远不止这个数字，NCBI公布的更多），在KEGG上公布全基因组序列的芽孢杆菌属菌种有：简称菌种名称测序时间测序链接bsu Bacillus subtilis1997RefSeqbss Bacillus subtilis subsp. spizizenii W232010RefSeqbst Bacillus subtilis subsp. spizizenii TU-B-102011 RefSeqbsn Bacillus subtilis BSn52011RefSeqbha Bacillus halodurans2000RefSeqban Bacillus anthracis Ames2003RefSeqbar Bacillus anthracis Ames 05812004RefSeqbat Bacillus anthracis Sterne2004 RefSeqbah Bacillus anthracis CDC 6842009 RefSeqbai Bacillus anthracis A02482009 RefSeqbal Bacillus cereus biovar anthracis CI2010RefSeqbce Bacillus cereus ATCC 145792003RefSeqbca Bacillus cereus ATCC 109872004RefSeqbcz Bacillus cereus ZK2004RefSeqbcr Bacillus cereus AH1872008 RefSeqbcb Bacillus cereus B42642008 RefSeqbcu Bacillus cereus AH8202009 RefSeqbcg Bacillus cereus G9******* RefSeqbcq Bacillus cereus Q12009RefSeqbcx Bacillus cereus 03BB1022009 RefSeqbcy Bacillus cytotoxis NVH 391-982007RefSeqbtk Bacillus thuringiensis 97-272004RefSeqbtl Bacillus thuringiensis Al Hakam2006RefSeqbtb Bacillus thuringiensis BMB1712010RefSeqbwe Bacillus weihenstephanensis2008 RefSeqbli Bacillus licheniformis ATCC 145802004RefSeqbld Bacillus licheniformis DSM132004RefSeqbay Bacillus amyloliquefaciens FZB422007RefSeqbao Bacillus amyloliquefaciens DSM 72010RefSeqbae Bacillus atrophaeus2010 RefSeqbcl Bacillus clausii2005 RefSeqbpu Bacillus pumilus2007RefSeqbpf Bacillus pseudofirmus2010 RefSeqbmq Bacillus megaterium QM B15512010 RefSeqbmd Bacillus megaterium DSM 3192010 RefSeqbse Bacillus selenitireducens2010 RefSeqbco Bacillus cellulosilyticus2011 RefSeqbck Bacillus coagulans2011 RefSeqbag Bacillus coagulans 36D12011 RefSeq第二节芽孢杆菌的表达系统发展简史芽孢杆菌表达系统是在70年代从枯草芽孢杆菌，又称枯草杆菌（Bacillus subtilis）开始，逐步扩展至其它种的。
枯草杆菌能发展成为芽孢杆菌中的第一个基因工程表达系统是与其早期的遗传学工作密切相关的。
Spizizen于1958年发现枯草杆菌168菌株为可转化菌株以来，枯草杆菌的遗传学工作不断深入和发展。
美国俄亥俄州立大学Bacillus遗传保藏中心（BGSC，/）至1999年保藏的168菌株的遗传突变株就有890个。
它牵涉到了诸多营养要求、各种酶、芽孢形成和发芽、感受态、Sigma因子、DNA重组与修复以及正负调控等各方面基因的突变体。
70年代发明了DNA重组技术以后，特别是发现金黄色葡萄球菌的带有抗性标志的质粒可作为枯草杆菌的载体以后，克服了枯草杆菌只有隐秘性质粒的困难，枯草杆菌基因工程的工作更是加速发展。
迄今，已经在枯草杆菌及其近缘种中克隆和表达了大量的原核和真核基因，其中有的已应用于工业化生产，取得了不少成绩。
将携有外源基因载体导入宿主细菌中是细菌基因工程表达系统的必要条件。
大肠杆菌的氯化钙转化法对枯草杆菌无效，所以枯草杆菌基因工程表达系统中的宿主菌株用的最广泛的就是在DNA重组技术发明之前就可以进行感受态转化的168菌株及其突变体。
Spizizen感受态转化的基本原理：是细胞在Spizizen最低盐培养基中形成一段饥饿、易于摄取外源DNA片段的时期。
一般步骤是先将其在较为丰富的培养基中培养，然后转接到贫瘠的培养基中，使其形成感受态（一般非常短暂）。
有关感受态时期参与摄取外源DNA的几种蛋白及其摄取机制已有初步的研究。
第二章枯草芽孢杆菌的转化系统第一节：常见转化方法1 化学转化法芽孢杆菌属不能够使用大肠杆菌常用的化学转化法，枯草芽孢杆菌表达系统中应用最为广泛的的宿主菌株是在DNA重组技术发明之前就可进行感受态转化的168菌株（色氨酸缺陷型）及其突变体。
对于B. subtilis来说，自然感受态是对数生长后期在一种二元信号转导系统的调节下形成的，需要一系列相关基因的调控。
按照这些基因的功能和表达时间的先后，它们被分为早期感受态基因和晚期感受态基因。
其中早期基因主要对感受态的形成起调节作用，并进一步促进晚期感受态基因的表达。
而后者主要负责细胞对外源DNA的吸附、吸收和重组。
B. subtilis的自然感受态是在对数生长后期开始形成的。
这种生理状态的形成受到感受态信息素的调节，只有当细胞达到一定的数目（一般在对数后期）时，细胞所分泌到培养基中的感受态信息素的浓度达到一定临界值时后，感受态才能被诱导形成。
2 电转化对于绝大多数微生物来说电转化是常见的转化效率最高的一种方法，芽孢杆菌属首次使用电转化方法转化出现在1989年，目前芽孢杆菌属内最常使用的B. subtilis的转化率已经达到104- 106。
对于化学转化法，芽孢杆菌属形成感受态的时间并不好把握，另外由于其感受态的形成受到诸多基因的控制，对于一些经过诱变的工业生产株，往往不能形成感受态，所以在实际操作中，一般采用电转化将外源DNA导入宿主细胞。
由于电转化方法具有操作简单、实验结果重现性好、参数容易控制等优点，目前已被许多实验室用来进行芽孢杆菌的基因转化。
但是，电转化法的操作条件对转化效率影响很大，因此最佳条件的建立非常重要。
影响电穿孔转化率的几个主要因素包括感受态的制备方法、电击压力、感受态和DNA溶液中离子浓度、复苏液的选择和复苏时间等。
3 原生质体转化原生质体转化技术是20世纪60年代发展起来的一项重要的分子生物学技术，是将细胞通过酶解破壁，使之成为球状的原生质体，然后与DNA混合于高渗缓冲液中，在聚乙二醇（PEG）介导下，使原生质体-DNA发生相互凝聚，进行遗传转化，然后在适宜的条件下再生细胞壁，获得转化子的过程。
原生质体转化开辟了育种工作的新途径。
自1953年Weibull 首次用溶菌酶酶解分离巨大芽孢杆菌的原生质体，1979年Chang等[创立了原生质体转化技术后，它很快应用在微生物中，并得到了证实，成功地实现了酵母菌、霉菌和细菌等微生物的转化。
B. subtilis经过一定处理后能够形成原生质球，这种原生质球经聚乙二醇（PEG）处理后，能再生细胞壁而成为转化细胞，这种转化的转化频率非常高，B. subtilis原生质球转化时有80%细胞被转化。