蛋白质与核酸的定性与定量一、实验目的1、学习和掌握纯化蛋白质的原理和方法、蛋白质等电点的测量原理和方法。

2、进一步掌握使用双缩脲法对蛋白质的定性测定、利用定糖法对核酸的定性与定量测定二、实验原理1、蛋白质的定性测定：双缩脲法，课本P992、蛋白质的定量测定：Folin-酚法，实验P193、核酸的定性与定量测定：定糖法，课本P131、4、蛋白质等电点的测量在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。

如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。

同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。

可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带pH梯度的组成pH梯度的组成方式有二种，一种是人工pH梯度，由于其不稳定，重复性差，现已不再使用。

另一种是天然pH梯度。

天然pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物，在正极端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在负极端引入碱液，如氢氧化钠、氨水等。

电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值，即各段介质中的pH相等，用pH0表示。

电泳开始后，混合物中pH最低的分子，带负电荷最多，pI1为其等电点，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面时，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1，这一分子不再向前移动而停留在此区域内。

由于两性电解质具有一定的缓冲能力，使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围。

pH稍高的第二种两性电解琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等5、蛋白质的纯化：凝胶层析，实验课本DEAE-Cellulose离子交换：氨基酸、蛋白质、核酸等大多是两性物质，在水溶液中带有电荷，由于生物分子自身的性质差异，造成了特定的介质中所带的点和种类和密度不同，这就是离子交换的理论依据。

离子交换现象可用下面的方程式表示：Resin-SO3H+Na+H+Resin-SO3Na+H+=Resin-SO3H+Na+\阴离子交换反应：Resin-N(CH3)3OH+Cl-=n(ch3)3Cl-+OH-二乙基氨基纤维素DEAE/view/9901378102d276a200292e37.html三、实验材料1、试剂(1)双缩脲试剂实验P13(2)Folin-酚试剂，实验P19(3)地衣酚试剂、二苯胺试剂(4)0.02mol/LNH4Ac、0.06mol/L NH4Ac流洗、0.3mol/L NH4Ac、1.5mol/LNaCl- 0.3mol/LNH4Ac2、器材（1）紫外检测仪、自动部份收集器、记录仪（2）M anifold聚焦盘、电极平台、样品杯四、实验方法1、双缩脲区分蛋白质与核酸2、蛋白质纯化1. 平衡:0.02mol/LNH4Ac缓冲液平衡离子交换柱，紫外检测仪、记录仪基线稳定;2. 上样:取下柱上端套塞，当柱上液面与凝胶床面相切，立即将样品小心而缓慢地加到柱床表面;3.洗涤:样品降至床面，用0.02mol/LNH4Ac洗涤柱壁1次;4. 收集γ-球蛋白:将0.02mol/LNH4Ac缓冲液充满层析柱，与高位恒压槽连通，开启自动部分收集器进行收集；5. 洗涤其他球蛋白:记录仪基线恢复到零后,用0.06mol/L NH4Ac流洗，不用进行收集6.收集白蛋白:待记录仪基线恢复到零后，用0.3mol/L NH4Ac缓冲液流洗，自动部分收集器进行收集;7. 柱上再生:待记录仪基线恢复到零后,用 1.5mol/LNaCl- 0.3mol/LNH4Ac流洗，不用进行收集;8. 再次平衡:待记录仪基线恢复到零后，用0.02mol/L NH4Ac流洗1-2个柱体积3、蛋白质等电点的测定/view/e45875cf05087632311212f5.html/p-36650008.htmlEttan IPGphor 3简要操作指南注意：•使用过程中，请确保室内温度在20！•该设备为高压设备，任何不当操作都可能会造成受伤或死亡！•该设备为双向电泳系统中的一个设备，请阅读双向电泳原理和方法手册了解其他信息！1．水化：⑴参照水化液用量表，将水化液或适量样品(若水化上样)混合；调节泡涨盘水平，液体小心加入泡涨盘。

⑵胶条室温平衡30min，从酸性端（尖端）一侧剥去IPG胶条的保护膜。

胶面朝下，先将IPG胶条尖端(阳性端)放入聚焦盘中，慢慢放下胶条，并前后拖动，避免生成气泡。

⑶从两端向中间加入约3ml覆盖油防止水分蒸发。

盖上泡涨盘上盖，室温水化至少10小时。

2．将Manifold聚焦盘放置在Ettan IPGphor 3的电极平台上，T形口对齐。

3．将已水化的IPG 胶条转移到任一聚焦盘胶条槽内。

胶面朝上，酸端放+极，碱端放－极，并确保胶条位于胶条槽的中央(聚焦盘胶条槽内四对凸起可用于指导胶条放置在居中位置)。

4．在每根IPG 胶条表面覆盖6-8ml Immobiline DryStrip 覆盖油，胶条附近的空胶条槽内也要加覆盖油。

5．取两个IEF 电极片，用去离子水浸湿后放在滤纸上，去除多余的水。

6．分别将两个IEF 电极片放在IPG 胶条胶的两端，将电极压在两个电极片的外缘，并关闭锁扣。

7．样品杯（若杯上样）可放在两个电极间除聚焦盘内侧凸起外任何位置（切忌放在凸起上），对于碱性分离范围的IPG 胶条，尽量将样品杯靠近阳极放置。

8．在样品杯中加入少量不含样品的水化液或者覆盖油检查是否漏液。

上样前吸走水化液。

9．上样前将样品离心去掉不溶物，每个样品杯可加样20-100μl，浓度不超过10mg/ml，加覆盖油覆盖样品。

10．盖上安全盖，开启电源，开关在仪器背面右侧。

开机后，系统经过自检后进入待机状态。

11．若需打开安全盖，只需按下安全盖即可解锁，同时运行暂停，只有重新合上安全盖后程序才会继续运行。

12．程序设置和选择：可通过安装在PC上的控制软件或在Ettan IPGphor 3面板上按键设置程序，在Ettan IPGphor 3上可以储存10个多达9步设置好的程序；这些设置好的程序可以直接调用，也可以在编辑后运行。

可以设置的参数包括水化温度和时间，等电聚焦时的最大电流，电压，温度及电压改变模式等。

请参见双向电泳原理和方法手册了解不同长度和pH范围胶条的推荐运行条件。

13．用左、右箭头将光移至Prot# 1处，用上、下箭头选择合适的方法号。

使用右向箭头移动光标至File，并用上、下箭头编辑方法名。

14．如果需要，设定溶胀时间、温度和等电聚焦的温度20度、最大电流50uA/strip 和胶条数等。

15．按EDIT键进入IEF参数设置：用左、右箭头将光移至需编辑参数处，用上、下箭头改变参数。

最多可以设定九步程序的电压、持续时间及电压改变模式。

16．再按一次EDIT键保存所有修改。

按START开始，输入胶条数，再次按下START 开始运行程序。

在运行过程中，按STOP键暂停程序；再按START键则继续运行；连续按二次STOP键则结束程序，并显示总的运行时间，伏小时数等参数。

17．待程序运行结束，关闭电源；取出胶条进行下一步实验。

清洁聚焦平台后盖好安全盖。

4、蛋白质定量测定5、区分DNA\RNA6、核酸的定量测定五、注意事项1、蛋白质的纯化：1．不同的蛋白质，具有不同的等电点。

在生产过程中应根据分离要求，除去目的产物之外的杂蛋白；若目的产物也是蛋白质，且等电点较高时，可先除去低于等电点的杂蛋白，如细胞色素C的等电点为10．7，在细胞色素C的提取纯化过程中，调pH＝6．0除去酸性蛋白，调pH＝7．5～8．0，除去碱性蛋白。

2．同一种蛋白质在不同条件下，等电点不同。

在盐溶液中，蛋白质若结合较多的阳离子，则等电点的pH值升高；因为结合阳离子后，正电荷相对增多，只有pH值升高才能达到等电点状态，如胰岛素在水溶液中的等电点为5．3，在含一定浓锌盐的水—丙酮溶液中的等电点为6；如果改变锌盐的浓度，等电点也会改变。

蛋白质若结合较多的阴离子(如C1-、SO42-等)，则等电点移向较低的pH值，因为负电荷相对增多了，只有降低pH值才能达到等电点状态。

3．目的药物成分对pH值的要求。

生产中应尽可能避免直接用强酸或强碱调节pH值，以免局部过酸或过碱，而引起目的药物成分蛋白或酶的变性。

另外，调节pH值所用的酸或碱应与原溶液中的盐或即将加入的盐相适应，如溶液中含硫酸铵时，可用硫酸或氨水调pH值，如原溶液中含有氯化钠时，可用盐酸或氢氧化钠调pH值。

总之，应以尽量不增加新物质为原则。

4．由于各种蛋白质在等电点时，仍存在一定的溶解度，使沉淀不完全，而多数蛋白质的等电点又都十分接近，因此当单独使用等点电沉淀法效果不理想时，可以考虑采用几种方法结合来实现沉淀分离。

等电聚焦电泳：1、两性电解质是等电聚焦的关键试剂，它的含量2﹪-3﹪较合适，能形成较好的pH梯度。

2、丙烯酰胺最好是经过重结晶的。

3、过硫酸铵一定要新配置。

4、所有水用重蒸水。

5、样品必须无离子，否则电泳时样品带可能走歪，拖带或根本不成带。

6、平板等电聚焦电泳的胶很薄，当电流稳定在8mA，电压上升到550V 以上，由于阴极飘移，造成局部电流过大，胶承受不了而被烧断。