2.1 PI单染检测
✓ 与细胞周期相同，利用PI染色，通过检测DNA含量来同时判定细胞周 期和凋亡。
✓ 凋亡过程中，细胞内核酸酶释放，细胞DNA发生有序降解，被降解的 低分子量DNA片段从变性细胞膜（经乙醇及透膜剂处理）漏出细胞外 ，使得凋亡细胞内的DNA含量减低，在流式细胞仪测定细胞DNA含量 直方图中G0/G1峰前可出现亚二倍体峰，即凋亡峰
入细胞后会被胞内酯酶所水解，产生的Fluo-4随后会和钙离子结合并发出荧光。
2.4 线粒体膜电位检测
✓ JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential) ΔΨm 的理想荧光探针。
✓ 线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(Jaggregates)，可以产生红色荧光……正常细胞
裂，胞内含物释出后FSC、SSC均变小。
2 细胞凋亡的流式检测方法
➢ 2.1 PI单染检测 ➢ 2.2 Annexin V/PI(7-AAD)双染检测 ➢ 2.3 细胞内钙离子测定 ➢ 2.4 线粒体膜电位检测 ➢ 2.5 Caspases细胞酶的检测 ➢ 2.6 DNA 碎片分析：Apo-BrdU ➢ 2.7 凋亡相关蛋白：Fas、Bcl-2、P53
✓ Fluo-4 将Fluo-3结构中的Cl替换成F ， 荧光强度比Fluo-3强1倍 ✓ Fluo-4与钙离子的亲和力和Fluo-3近似，使用上和Fluo-3也基本相同，可以使用流
式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。 ✓ Fluo-4-AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，通过培养，能够轻易进入细胞中。AM进
目录
1
细胞凋亡与细胞坏死
2
细胞凋亡的流式检测方法
3
流式检测细胞凋亡面临的问题
1.1 细胞凋亡
➢ 细胞凋亡(Apoptosis)是指细胞基因调控的一种自主性的自杀现象。或者说在一 定的生理或病理条件下，细胞遵循自身的程序，自我结束生命的死亡方式。
➢ 程序性细胞死亡(Programmed Cell Death, PCD) ➢ 细胞凋亡同细胞分裂、细胞分化一样，是机体生存和发育离不开的最基本生
细胞凋亡与细胞坏死的区别
———————————————————
坏死
凋亡
———————————————————
1.性质
病理性，非特异性
生理性或病理性，特异性
2.诱导因素 强烈刺激，随机发生
较弱刺激，非随机发生
3.生化特点 被动过程，无新蛋白合成，不耗能 主动过程，有新蛋白合成，耗能
4.形态变化 5.炎症反应
➢ 凋亡小体的形成。核膜核仁破碎，核染色质断裂为大小不等的片段，与某些 细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞膜所包围；
➢凋 亡 小 体 逐 渐 被 周 围 专 职 或 非 专 职 吞 噬 细 胞 吞 噬 。
1.2 细胞坏死
➢ 是细胞受到严重损伤或大剂量细胞毒药物作用后出现的反应。 ➢ 早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀。 ➢ 继而溶酶体破裂,细胞内容物流出, 引起炎症。
✓ 通过峰下的面积值可得出凋亡细胞在所测细胞群中所占的比率。
✓ PI单染色法的最大优点在于获得凋亡细胞百分数的 同时可以与细胞周期中其 他时相的细胞进行比较
✓ 该法简便、标本制备容易、检测费用低
✓ 缺点：PI单染色法无法确认来自哪一时相的凋亡，对于S 期和G2/M 期的细胞 发生凋亡时，凋亡峰有时与G1 峰或S 峰相互重叠，导致G1 峰或S 峰增宽而无 典型的sub-G1 峰出现，所以无法分析来自S 期或G2/M 期细胞的凋亡，应借 助其他方法进行检测
物现象，通过凋亡可以平衡机体内细胞的数目，清除衰老、过剩、有害的细胞 。
与细胞凋亡有关的疾病
细胞凋亡的形态特征
➢ 凋亡的起始：微绒毛消失，细胞间接触消失，与周围细胞脱离，细胞质中线 粒体大体完整，染色质固缩；
➢ 细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆， 膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面；
✓ PI(7-AAD)可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现 红色荧光。对于坏死细胞，由于细胞膜的完整性已经丧失， Annexin V可以 进入到细胞浆内，与位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合，从而也使坏死 细胞呈现绿色荧光。
✓ 此法简单、可靠，由于xin V/PI(或7- AAD )双染色是检测 早期凋亡细胞的敏感方法。
✓ 由于该法必须用活细胞，因此检测时间 受到限制，且对凋亡晚期细胞和坏死细 胞无法准确区分。
2.3 细胞内钙离子测定
✓ Fluo-3-Am为新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂，进入细胞后经非特异性酯酶脱 去Am酯，成为脂溶Fluo-3留在细胞内，当Fluo-3与胞内游离钙结合后，其荧光强 度是Fluo-3本身的40倍以上，当用480nm波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓 度成正比。
✓ 线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体 (monomer)，可以产生绿色荧光……凋亡细胞
细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀 溶酶体破裂，局部炎症反应
胞膜及细胞器相对完整细胞 皱缩，核固缩
溶酶体相对完整，局部无炎症反 应
6.DNA电泳 弥散性降解，电泳呈均一DNA片 状
7.凋亡小体
无
8.基因调控
无
DNA片段化（180-200bp），电泳呈 “梯”状条带
有
有
2 细胞凋亡的流式检测方法
➢ 利用流式仪测定细胞光散射可对凋亡细胞进行分析 ✓ 凋亡早期细胞因体积减小，胞浆及染色质固缩，FSC变小，SSC增大 ✓ 凋亡晚期细胞FSC、SSC均变小 ✓ 坏死细胞则因细胞膜通透性改变，细胞肿胀，FSC、SSC变大，胞膜破
2.2 Annexin V/PI(7-AAD)双染检测
✓ 磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）异位：正常情况下，PS位于细胞膜内 层，细胞发生凋亡时PS从细胞膜内翻转并暴露在细胞膜外层，是细胞发生凋 亡的早期事件。
✓ Annexin V选择性结合PS 。用带有荧光标记的Annexin V，就可以用流式细 胞仪非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特 征。