第一章食品生物技术一、细胞工程1、概念：是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，在细胞水平上的遗传操作，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。

2、细胞工程主要包括：1.细胞融合2.细胞拆分 3.染色体工程 4.细胞培养工程2.1 细胞融合（1）概念：用人工方法使2种或2种以上的体细胞合并形成一个细胞，不经过有性生殖过程而得到杂种细胞的方法，用人工方法使2种或2种以上的体细胞合并形成一个细胞，不经过有性生殖过程而得到杂种细胞的方法。

（2）Somatic Hybridization（体细胞杂交）2.2 细胞拆合工程（1）概念：是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核质的重新组合，重建成新细胞。

（2）Somatic Cell Nuclear Transfer Cloning（体细胞细胞核移植克隆）：Donor somatic cell/nuclei （捐赠者体细胞核）（宿主细胞或者蛋白质或细胞质）2.3 染色体工程（1）概念：是按照预先的设计，添加、消除或替代同种或异种染色体的全部或一部分，从而达到定向改变生物遗传性状或选育新品种的目的。

他是从染色体水平改变细胞遗传组成的细胞工程技术。

目前主要应用于植物遗传育种领域。

2.4 细胞培养工程（1）概念：是细胞工程中重要的组成部分，是在人工条件下高密度大规模培养动、植物细胞来生产生物产品的技术。

如今这一技术已广泛应用于现代生物制药和食品研究和生产中。

为生产疫苗、细胞因子、生物产品和食品配料提供了强有力的工具。

二、动物细胞工程（一）动物细胞培养1、细胞原代培养（1）取材分离：取出组织块放入小烧杯中，用剪刀将组织块剪碎（2）组织消化：是用酶法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。

（3）细胞悬液配制：细胞悬液制成后，需要计数,了解悬液中细胞的浓度，然后接种培养。

2、微载体培养（microcarrier culture)：将细胞固定在微载体上培养贴壁培养的过程。

微载体是直径为60-250μm的微珠。

（二）胚胎干细胞技术1、综述：1999年12月，美国《科学》杂志公布了当年世界科学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。

2、概念：干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。

2.1干细胞的主要特征：（1）具有分化成各种特定细胞的能力；（2）它们可无限地分裂产生大量后裔；（3）其子细胞有两种命运，保持为干细胞或分化为特定细胞。

2.2胚胎干细胞过程：既可以体外培养也可以体内培养3、传代培养：当原代培养成功后，细胞分裂增殖扩展连片，占满器皿表面。

这时需要对其分离重新培养，这一操作过程称之为传代。

3.1组织块初代培养过程：3.2具体方法：（1）吸出培养瓶内旧培养液；（2）加人胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底对细胞进行消化；（3）吸出消化液，加人Hanks液，洗去残留的消化液。

（4）加入培养液，用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液，计数后记录其浓度；（5）重新接种培养。

3.3消化法传代培养过程：（三）体细胞核移植1综述：体细胞核移植属于细胞拆合工程。

1996年7月英国罗斯林研究所Ian Wilmut及其合作者以高度分化的成年母羊乳腺细胞为核供体，克隆出一只绵羊，取名Dolly。

成果1997年2月27日发表在NATURE VOL385，该成果获得1997年世界十大科技成就之首。

2过程：（1）1996年，Wilmut和他的同事们从一只白色妊娠绵羊的乳腺刮下若干个乳腺膜细胞。

（2）然后，从形体较小的苏格兰黑面羊摘取卵细胞，去除其细胞核（DNA）。

（3）把白羊的乳腺细胞核放入黑羊的已去除细胞核的卵细胞中，用电脉冲使这些细胞融合在一起。

（4）将合成的卵细胞早期胚胎植入另一只黑面母羊体内。

（5）4个月之后，这只举世震惊的小羊羔诞生了，椐罗斯林研究所宣布，他们实验了834次才成功了一只多利。

3体细胞核移植：卵细胞核被移出，供体细胞核被移入卵细胞。

电激融合，形成融合细胞。

融合细胞进行繁殖。

4这一成果的重要的生物学意义：它证明了一个已经完全分化了的动物体细胞仍然保持着当初胚胎细胞的全部遗传信息，并且经此技术处理后，体细胞恢复了失去的全能性形成完整个体。

三、植物细胞工程（一）综述发展1 植物是各种药物、色素、香精和酶的主要来源；已知的30000种天然化合物中，80%来源于植物。

我国使用的中药80%来源于植物，美国植物来源的药物每年超过35亿，世界每年植物来源的香料超过20亿。

2 1904年Hanning成功地培养了萝卜和辣根菜的胚，发现离体的胚可以充分发育，并在培养条件下提前萌发形成小苗。

离体培养第一个成功的例子。

3 1958年Steward和Shanu以胡萝卜根韧皮部细胞为材料，经液体震荡培养得到完整的小植物，并开花结实。

实验结果震动很大，一个普通的营养细胞（体细胞）发育成为一个完整的植物体。

4 60年代，植物细胞反应器、细胞培养动力学、次生代谢产物调节理论取得进展。

Morel 采用兰花茎尖培养，达到脱毒和快繁两个目的，推动了世界兰花工业发展。

5 1983年，日本三井石油化学公司成功进行紫草细胞工业化培养生产紫草宁。

6 人参细胞生物反应器培养，迄今为止，全世界已对近千种植物进行过细胞培养研究,从400种植物中分离出细胞培养生产其代谢产物，这些天然产物包括药品、香料、色素、食品和化妆品等共600多种。

（二）植物细胞培养应用前景1 植物细胞培养在工业上主要应用于:（1）获得细胞或次级代谢物；（2）进行生物转化，将外源底物转化为所需产物；（3）在农业上主要应用于种质保存；（4）人工种子的制备；（5）植株的大规模快速繁殖。

2 优点：一、高效率：（1）植物细胞生长一般生产周期15～30d，与完整植物的生长周期比较，却是大大地缩短了生产周期。

（2）一般植物从发芽、生长到收获，短则几个月，长则数年甚至更长时间。

例如，木瓜的生长周期一般为8个月，紫草为5年，野山参则更长。

二、易于管理，减轻劳动强度：（1）植物细胞培养在人工控制条件的生物反应器中进行生产，不受地理环境和气候条件等的影响。

（2）易于操作管理，大大减轻劳动强度，改善劳动条件。

三、进行生物转化，将外源底物转化为所需的产物（1）生物转化即通过植物细胞内生成和积累的各种酶的催化作用，将外源底物转化为药物、食品添加剂等具有较高应用价值的产物。

（2）植物细胞生物转化具有：转化率高、选择性强、副产物少等显著特点。

（三）植物细胞和组织培养1 植物细胞和组织培养（plant cell and tissue culture, PCTC）1.1概念：将植物的器官、组织、细胞或细胞器进行离体、无菌培养，并重新再生成细胞或植株的过程为植物细胞和组织培养。

1.2植物细胞和组织培养主要包括：①植物器官培养：包括离体的器官如根尖、茎尖、叶原基、花器官各部分原基和果实在适当条件下进行无菌培养，以及从各种器官增殖而形成愈伤组织的培养。

②离体胚胎培养：包括成熟或未成熟的胚胎离体培养，通常使用相应的培养基使离体胚正常的萌发生殖，以供研究和操作使用。

③植物细胞培养：是指在无菌条件下，将植物细胞从机体内分离出来，在营养培养基上使其生存和生长的一种方法。

将植物微生物化，在一定容积的反应器中得到大量的植物细胞。

植物细胞培养主要依据“细胞的全能性”。

④原生质体培养：将植物细胞去除细胞壁形成原生质体后进行培养，它是利用原生质体进行操作的基础。

2外植体（explant）：植物组织培养中,作为离体培养材料的器官或组织的片段统称为外植体。

3愈伤组织（callus）:是由母体外植体组织的增生细胞产生的一团不定型的疏松排列的薄壁细胞。

一般愈伤组织在培养中没有明显的组织或器官的分化。

4细胞全能性（cell totipotency）:是指植物体的每个细胞在离体条件下都具有诱导生长分化形成完整植株的潜在能力，这是由于每个细胞都有一套完整的基因组而实现的。

（四）植物细胞培养的方法1单细胞培养1.1概念：是从外植体、愈伤组织、细胞团中分离得到单细胞，然后在一定条件下进行培养的过程。

（1）通过单细胞培养可以观察细胞个体的分裂、生长和繁殖情况，可以获得细胞团，进而得到从单细胞形成的细胞系。

（2）从单细胞分裂、繁殖得到的细胞团和细胞系，可以认为具有相同的基因和特性。

（3）用这种细胞系迸行大规模细胞培养，得到较为均一的细胞及其代谢产物。

1.2植物单细胞的获得1.2.1从外植体直接分离单细胞（1）外植体经过切割、捣碎或酶解，然后经过一定孔径的不锈钢筛网过滤，得到细胞悬浮液。

（2）悬浮液中所含的完整细胞数量很少，分散性较好，可以看作是游离的单细胞悬浮液。

1.2.2从愈伤组织分离单细胞（1）经过愈伤组织诱导获得脱分化愈伤组织的薄壁细胞团。

（2）将细胞团转移到液体培养基中，进行振荡培养，使细胞团分散成为单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去细胞团和残渣，得到单细胞悬浮液。

1.2.3通过原生质体再生法获取单细胞（1）外植体、愈伤组织或细胞团经过纤维素酶和果胶酶等的作用，除去细胞壁而获得原生质体。

（2）原生质体分离后，经过计数和适当稀释，在一定条件下进行原生质体培养，使细胞壁再生，而获得单细胞悬浮液。

1.3植物单细胞培养的方法：由于植物细胞具有群体生长特性，单细胞往往难以生长、繁殖。

为此，需要采用一些特殊技术。

（五）植物原生质体培养和体细胞融合1植物原生质体培养1.1原生质体的分离方法1.1.1概念：植物体的幼嫩部分、疏松易碎的愈伤组织或悬浮培养的细胞是制备原生质体的理想材料。

1.1.2方法：（1）酶解分离法：植物细胞外面的细胞壁的主要成分为纤维素、半纤维素、果胶质和少量蛋白质等。

利用从微生物中提取的纤维素酶和果胶酶可以分解植物细胞壁，大量制备原生质体。

（2）原生质体的纯化方法：原生质体的纯化即净化。

酶解后的原生质体溶液中，有完整的原生质体、破碎的原生质体、未去壁的细胞、细胞器及其他碎片。

1.2原生质体的培养方法（1）固体培养：与单细胞的平板培养方法相仿，将原生质体悬浮液与等量琼脂的固体培养基混合均匀培养；经过细胞壁再生，细胞生长繁殖，获得由原生质体形成的细胞团的过程。

（2）液体静止培养：液体静止培养是将植物原生质体接种于液体培养基中，在静止的条件下进行培养，经过细胞壁再生，形成单细胞，再分裂形成细胞团的过程。

2植物原生质体融合2.1概念：两种异源原生质体，在诱导剂诱发下相互接触，从而发生原生质体膜融合，胞质融合和核融合并形成杂种细胞，进一步发育成杂种植物体，称为原生质体融合，或体细胞杂交（Somatic Hybridization）。