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菌丝培养基 葡萄糖含量为0.5%的葡萄糖-蛋白胨完全培养基。
高渗再生培养基 以1.2mol/L Sorbitol（山梨糖醇）配制的葡萄糖-蛋白胨基本固体培养基。
0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）：0.2 mol/L NaH2PO4·2H2O（约240mL） 和0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O（约60mL）混合至pH为6.0
酶解1-2h，将培养皿内破碎菌丝体和原生质体混合液用吸管吹吸数次， 用G2或G3砂芯漏斗过滤，使原生质体同菌丝体碎片分开，滤液15002000r/min离心10min，洗涤去上清，悬浮于同一高渗溶液中。再将含 有原生质体的滤液用再生培养基洗涤三次，以清除酶液，然后用保存 液悬浮。血球计数板计数，冷藏备用。

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将制备好的原生质体溶液3200r/min，4℃离心10min； 弃上清，沉淀重悬于预冷的STC溶液中，将原生质体浓度调整为 5×106 ~ 5×107个细胞/mL； 将约2~5µg质粒DNA(体积不超过10µL)与100µL米曲霉原生质体置冰上 轻轻混匀； 加入25µL PTC溶液，冰浴20min； 加入1 mL PTC溶液，室温放置15min； 最后加入2mL STC溶液，混匀。 将适量上述转化液涂布于高渗再生基本培养基上，30℃培养5~7天，所 长出的菌落即为转化成功的菌株；同时设置未加质粒而转化的原生质体 涂布平板作为阴性对照。
*再生培养基：同查氏培养基，其中含NaCl浓度为0.8mol/L

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*缓冲液：pH5.8-6.8磷酸氢二钠-柠檬酸溶液 *高渗溶液：0.6mol/L NaCl溶液 *酶溶液：蜗牛酶、纤维素酶，用0.7mol/L的NaCl配制，G6砂芯漏 斗抽滤除菌
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菌丝体培养60 h,用1. 5%溶菌酶+ 0. 5%蜗牛酶混合酶液, pH值 6. 0～6. 5,温度30～35 ℃,酶解4 h,以0. 7mol/L甘露醇为稳渗剂, 此条件下原生质体产量可达1. 68 ×107 个/ml。 PDA再生培养基, 稳渗剂为0. 5 mol/L蔗糖,双层固体培养,此条 件下原生质体再生率可达6. 05% ～6. 12%

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混合酶液：2%纤维素酶，1%蜗牛酶，5mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）用pH6.0的 含0.4 mol/L NH4Cl的0.2mol/L磷酸缓冲液配置混合酶液，经0.45µm微孔滤膜过 滤除菌，保存于4℃
PTC溶液：25%PEG8000，50mmol/L CaCl2，10mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)

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原生质体制备
培养时间 酶种类和浓度 酶解时间 酶解温度 渗透压稳定剂 22h 单一蜗牛酶，3% 2.5h 36℃ 无机盐溶液有利于 原生质体的释放，而糖 醇类不利于原生质体释 放（NaCl）
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培养基成分 高渗溶液（有机/无机） 缓冲液的pH（5.8-7.4） 酶解条件（时间/各种酶的比例） 酶液用高盐还是高渗缓冲液配 擦镜纸收集菌丝体or离心收集菌丝体 双层or单层培养基

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取培养20h的康氏木霉菌丝体悬液10mL，4000r/min离心30min 收集菌丝体，用无菌水4000r/min离心30min洗涤2次，加2.0%蜗 牛酶溶液30℃水浴酶解至原生质体形成率接近100%时停止酶解， 用0.6mol/L NaCl 5min条件下离心洗涤2次，最后将原生质体悬 于0.6mol/L NaCl溶液中。 在原生质体制备过程中每隔一定时间取酶解液制成水封片于显 微镜下观察。

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《工业微生物育种学》 施巧琴 吴松刚 *菌丝培养基： 1、葡萄糖蛋白胨培养基 2、PDA培养基（一种普遍用于酵母菌和霉菌计数培养用的培养基，被推荐 用于各类食品和饮料中酵母菌和霉菌检测和计数 ） 3、査氏培养基（用于真菌的分离鉴定，霉菌、白色念珠菌、酵母等微生物）
双层平板，再生，计算原生质体再生率。
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林艳学姐： 挑Aspergillus oryzae P5菌丝于葡萄糖-蛋白胨斜面培养基上培养6~7天，至孢子 成黄绿色 取新鲜培养的斜面7支，用20mL无菌水洗下成熟孢子于铺满玻璃珠的三角瓶中， 置摇床上150r/min振荡分散30min 经四层无菌镜头纸过滤，制成孢子浓度约为107个/mL的单孢子悬浮液 将上述制得的孢子悬浮液每1mL接种于一瓶盛有50mL菌丝培养基的三角瓶中，于 30℃静止培养23~25h 6000r/min，离心10min收集幼嫩的菌丝体 用无菌水洗涤菌丝体，4000r/min，离心5min收集菌丝体 用PBA溶液洗涤菌丝体两次，每次4000r/min，离心5min收集菌丝体
1、接种于液体培养基上培养。
2、取培养液10ml，4000r/min离心5min, 弃上清液，用Tris-HCl(pH 7.4)、 0.5mol/LEDTA、高渗缓冲液各洗涤一次。 3、用含10mmol/L巯基乙醇的高渗缓冲液稀释裂解酶液。 4、加酶液，100r/min摇床50-100min酶解。脱壁效果达70%左右即停止酶解。 5、100r/min离心三分钟，去沉淀，取上清。再2000r/min离心10min收集沉 淀原生质体。 6、高渗缓冲液洗涤2次，2000r/min离心10min收集原生质体，最终用1ml高 渗缓冲液悬浮原生质体。
STC溶液：1.2mol/L Sorbitol，50mmol/L CaCl2，10mmol/L TrisLogo
王金良学长： 1. 米曲霉C-2在2% G-P斜面培养6天至长出孢子，灭菌去离子水洗下孢子，经四层 擦镜纸过滤制成孢子悬液，接种于50mL 0.5%G-P菌丝全培养基，30℃静置培养 23~25h； 2. 过滤收集菌体，用无菌水与0.8M NaCl各洗涤一次； 3. 菌体置于灭菌培养皿中，加入15ml 酶解液（2%纤维素酶、1%蜗牛酶、3mM DTT）； 4. 置30℃摇床（80r/min）酶解3h左右，在显微镜下观察原生质体的释放情况； 5. 酶解完全后，四层擦镜纸过滤，除去未酶解菌丝，离心收集原生质体； 6. 用0.8M NaCl洗涤二次，0.8M NaCl-50mM CaCl2 洗涤一次； 7. 弃上清原生质体重悬于100µL 0.8M NaCl-50mM CaCl2中，血球板计数。

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1、原生质体混合、PEG助融 2、双层平板：底层10ml的固体培养基（1.2%琼脂），将样品加入 5ml融化后的半固体培养基（0.6%琼脂，预保温42℃）中，快速混合， 导入铺有底层培养基的平板上。待上层凝固后，置于恒温箱培养

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取原生质体悬液1mL与5mL上层再生培养基混匀，倾倒于下层再生 培养基平板上，待培养基凝固后于28℃培养箱中倒置培养。用下式 计算再生率： 再生率（%）=（A-B）/C×100% 式中：A为经高渗溶液稀释的原生质体在再生培养基上长出的菌落 数；B为经无菌水稀释的原生质体在再生培养基上长出的菌落数； C为显微镜下计数的原生质体数。

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取107个/mL的单孢子悬浮液 ，涂布于平板表面的玻璃纸上，培养后用 无菌镊子将培养菌丝体的玻璃纸转移并倒复在已配好的酶液内，轻轻 抖动玻璃纸，菌丝体散落在酶液中，然后去玻璃纸，酶解，定时取样 观察。 （该法收集的菌丝体会十分干净，免去了洗涤、离心等手续，减少对 菌丝的伤害和杂菌污染）
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文献汇报
2011.3.3
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培养基成分 高渗溶液（有机/无机） 缓冲液的pH（5.8-7.4） 酶解条件（时间/各种酶的比例） 酶液用高盐还是高渗缓冲液配 擦镜纸收集菌丝体or离心收集菌丝体 双层or单层培养基

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高渗缓冲液： 《微生物学实验教程》 周德庆（酵母） 蔗糖0.5mol/L, MgCl2 10mmol/L,Tris-HCl(pH 7.4) 10mmol/L
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以0.15g湿菌体用酶量1mL的比例，加入酶液，置于灭菌平板中
置33℃摇床上80r/min振荡酶解，每半小时取样，在显微镜下观察原生质体的释放 情况 待酶解完全后，加等体积1mol/L山梨醇溶液，用四层无菌镜头纸过滤，除去未酶 解的菌丝体残片，收集原生质体液 4000r/min室温离心10min，收集原生质体沉淀 去上清，沉淀用1mol/L 山梨醇溶液洗涤2次，每次4000r/min离心10min 弃上清将原生质体悬浮于5mL 1mol/L 山梨醇溶液中，-70℃冰箱冷冻保存备用
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1、将构建的pMD-pyrG质粒与100µL原生质体置冰上轻轻混匀； 加入25µL预冷PTC，冰浴30 min； 2、再加入500µL上述PTC溶液，平静混匀，室温20min； 加入预冷1mL 0.8M NaCl-50mM CaCl2 ，混匀； 3、与100mL米曲霉高渗再生培养基混合，倒平板； 30℃培养4-7天。
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原生质体再生
酶种类和浓度 酶解温度 渗透压稳定剂 单一蜗牛酶，2% 30℃ 糖﹑醇类有利于原生质 体的再生而无机盐类物 质不利于再生（蔗糖） 0.8mol/L
再生培养基中蔗糖浓度
康氏木霉原生质体制备的最适菌龄为22h，蜗牛酶浓度为2.0%，酶 解温度为30℃，酶解时间为2.5h，蜗牛酶溶液中的渗透压稳定剂为 0.6mol/L NaCl，再生培养基中的渗透压稳定剂为0.8mol/L蔗糖