• 包括：调控区(调节基因，启动基因， 操作基因)、 结构基因
基因克隆与表达
5、原核生物中参与转录的基因结 构：
• 启动子 • 终止子
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启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合
酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA序列。 • 一般长40-60bp，富含A-T碱基对 • 具有保守序列： -10区（pribnow box）：TATAAT -35区：
基因的克隆与表达
基因克隆与表达
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基因克隆与表达
基因克 隆 Gene Cloning
基因克隆与表达
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
基因克隆与表达
一、概述
一个相同酶切位点，可将另一末端补平
基因克隆与表达
2、平末端连接： • 酶切点为平末端或任何两个末端补平
的DNA • 效率低，酶用量大
基因克隆与表达
3、人工接头连接 人工接头：人工合成含有酶切位点的寡
核苷酸片段
基因克隆与表达
4、T-A克隆 • T-vector两条链的5’端含有一个游
离的T • PCR过程中，普通的Taq酶可在产
（二）体外重组 连接体系的建立： • 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数
=1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
基因克隆与表达
（三）转化—Cacl2法、电击法
（四）重组子的筛选及鉴定
1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
原位杂交
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
4、原核生物中功能相关的基因串联在 一起，形成操纵子。
基因克隆与表达
操纵子（operon）：是一组功能上相 关，受同一调控区控制的基因组成的 一个遗传单位
基因克隆与表达
• 原核生物基因表达的基本单位（即一 个转录单位）。
• 共同协调作用，完成某一多肽的表达 调控。
无特异的内源性核酸内切酶 载体复制、扩增不受阻 与载体有互补性
基因克隆与表达
四、体外重组的策略
1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 • 最方便简单 • 高背景-载体自身环化 • 双向插入
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2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
• 粘-粘连接：最有效、最快捷 • 粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有
基因克隆与表达
基因克隆的技术路线
目的基因
载体
体外重组
重组子（杂合DNA）
转化
受体细胞
筛选阳性克隆
大量扩增，获得子代DNA
基因克隆与表达
基因克隆与表达
二、克隆载体 ➢复制基因(replicator) ➢选择性记号 ➢克隆位点
基因克隆与表达
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是 重组体扩增的场所。 2、要求：易于接纳外源DNA
• 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆 子载体是DNA而不是蛋白质
• 揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机理
• 提出了中心法则和操纵子学说，破译了 遗传密码
基因克隆与表达
1973年Cohen完成第一个基因工程实验 经体外重组获得杂合DNA 杂合子转化入大肠杆菌
➢所需元件： 限制性内切酶 连接酶 载体 受体细胞
基因克隆与表达
4、PCR扩增目的基因片段 • 适用于克隆序列清楚的基因 • 以基因组DNA为模板，直接进行PCR
扩增较难 • 多采用以mRNA为模板的RT-PCR法
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5、人工合成较短的DNA 6、差异显示法(differential display,
DD)—筛选差异表达的基因
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2．真核表达系统：使外源基因在真核细 胞中表达的体系。
基因克隆与表达
二．原核生物基因结构和表达特点
基因克隆与表达
1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
基因克隆与表达
library)以组织细胞中的mRNA为模 板，反转录合成双链cDNA ，各 cDNA分子分别插入载体形成重组子， 再导入宿主细胞克隆扩增。这的3’端多加一个A
基因克隆与表达
五、基因克隆的工作流程
（一）目的基因的获得
1、直接分离3、构建cDNA4、PBiblioteka BaiduR
5、人工合成
6、差异显示
基因克隆与表达
1、直接物的基因组DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后 导入宿主细胞，进行克隆。这些存 在于所有重组、鉴定：
• 长度鉴定：酶切、PCR
• 方向鉴定：联合酶切
• 测序
基因克隆与表达
基因的表达
Gene Expression
基因克隆与表达
一．表达系统： 基因工程中用来获得有功能的异源蛋白 质的体系，包括克隆载体，表达载体及 受体细胞。
基因克隆与表达
基因克隆与表达
据受体细胞的不同可分为：
1．原核表达系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原 核细胞中以发酵形式快速高效地表达、 合成基因产物的体系。
基因克隆与表达
基因克隆（分子克隆molecular cloning）----通过体外重组技术,将一 段目的DNA经切割、连接插入适当载 体，并导入受体细胞，扩增形成大量 子代分子的过程。
基因克隆与表达
基因克隆的核心-----体外重组 (Recombination) : 人工将一段目的DNA 插入一个载体的过程。
基因克隆与表达
•构建流程
抽提基因组 DNA 鸟枪法制备DNA片 段 DNA片段与载体重组
转化宿主菌
筛选目的基因（核酸探针法、 免疫结合法）
基因克隆与表达
• 特点及应用： 包含所有遗传信息 构建难度大（单拷贝基因、长片段基因） 筛选难度大 用于研究基因在基因组中的情况
基因克隆与表达3、构建cDNA，筛选目的基因 • cDNA(complementary DNA