经典猪高热病毒抗原ELISA试剂盒
JENO Biotech Inc.
描述：VD Pro®CSFV抗原检测试剂盒采用双夹心ELISA法。

介绍：
CSFV抗原ELISA检测试剂盒是用来检测CSFV感染的细胞、白细胞以及猪组织提取物样品中是否存在CSFV抗原。

此检测方法快速、简单、特异性好，而且与其它瘟病毒属病毒如牛病毒性腹泻粘膜病病毒（BVDV）和博尔纳病病毒（BDV）之间不存在交叉反应。

CSFV抗原ELISA检测试剂盒与反转录聚合酶链式反应（RT-PCT）和病毒分离有很好的相关性。

原理：
CSFV抗原ELISA检测试剂盒是在抗E2单克隆抗体包被的ELISA板上进行的。

白细胞、组织匀浆液或组织培养液的提取样品或稀释样品滴加到ELISA板的每一个孔里，如果样品中存在病毒抗原（gp55），在滴加过氧化物酶连接的抗E2单克隆抗体和TMB显色液后颜色会发生变化。

结果用OD的比值来表示，由样品孔中的OD值和阳性对照孔中的OD 值得出。

试剂盒成分
1. CSFV抗E2单克隆抗体包被的板子………………………………………....2块
2. 10×样品处理缓冲液（STB）………………………………………………..30ml
3. 10×洗涤液…………………………………………………………………….100ml
4. 全血处理缓冲液（WTB）……………………………………………..…….100ml
5. 稀释缓冲液………………………………………………………………...….50ml
6. HRPO 抗-CSFV连接液………………………………………………..……..20ml
7. 强阳性对照（SPC）…………………………………………………………..1.0ml
8. 弱阳性对照（WPC）…………………………………………………………1.0ml
9. 阴性对照（NC）…………………………………………………………..….1.0ml
10. TMB显色液…………………………………………………………………..20ml
11. 终止液………………………………………………………………..……….10ml
12. 指导手册……………………..……………………………………………….1份
重要的注意事项
在开始任一程序时请阅读下列注意事项。

警告
1. 不要混合不同批次试剂盒的成分。

2. 不要使用过期的产品。

3. 实验结束后，用蒸馏水洗涤仪器。

4. 注意防止试剂盒成分污染。

贮存注意事项
所有试剂储存在2-8℃，直至过期。

使用时试剂恢复到室温，使用完毕后继续放到2-8℃。

样品准备
样品可以储存在-70℃，但是为了得到准确的结果尽量使用新鲜样品。

每一动物取1-2个组织，优先取脾、扁桃体、肺、脑、肠系膜淋巴结或肾。

一般来说脾和扁桃体样品得到的结果最敏感。

1. 用剪刀将1-2g的组织剪成小块。

2. 将组织块放入研钵，加3-5ml1×样品处理缓冲液(STB)，并加少量海砂。

3. 磨碎组织，室温孵育1小时并轻轻摇动。

4. 12,000×g离心1min（或1,500×g离心10 min），取上清备用。

白细胞浓缩液
●用Ficoll密度梯度离心分离白细胞
1. 向离心管中3mlFicoll密度梯度分离液（ex, Histopaque-1077®）表面小心地覆盖3ml肝
素或EDTA抗凝血液。

2. 1,000×g离心10min，用移液管从离心管中吸取约1ml白细胞层，然后与0.5mlPBS混匀。

3. 12,000×g离心白细胞1min，弃上清液。

4. 用300μl 1×STB重悬白细胞，涡旋机上充分混匀，室温孵育1h并轻轻搅动。

5. 12,000×g离心1min（或1,500×g离心10 min），取上清备用。

●用LuecoSep®分离白细胞
1. 向LuecoSep®(Gieiner)中加入3ml Ficoll密度梯度分离液（Histopaque-1077®），1,000×g
离心30s。

2. 向LuecoSep®中加入3ml肝素或EDTA抗凝血液，1,000×g离心10min。

3. 分离相（例如）
血浆-白细胞-Histopaque-盘状物- Histopaque-RBC
用移液管吸取1ml白细胞层，与0.5ml PBS混匀。

4. 12,000×g离心白细胞1min，弃上清液。

5. 用300μl 1×STB重悬白细胞。

涡旋机上充分混匀，室温孵育1h并轻轻搅动。

6. 12,000×g离心1min（或1,500×g离心10 min），取上清备用。

全血
全血可能是筛选检查有效的样品，但敏感性较白细胞浓缩液差。

如果全血样品有阳性反应，那么白细胞浓缩液或组织提取液也可以确定为阳性。

1. 轻轻翻转管子混匀全血样品。

如何血液出现凝结，应重新收集样品。

2. 全血样品与全血处理缓冲液（WTB）等体积混匀，室温孵育10 min。

A．微孔板：500μl全血和500μlWTB。

B．圆锥形管：5ml全血和5mlWTB。

3. 12,000×g离心3-5min（或1,500×g离心10 min），弃上清液。

4. 吹散沉淀，加等体积的1×STB（微孔板为100-200μl）。

涡旋机上充分混匀，室温孵育
1h并轻轻搅动。

5. 12,000×g离心1min（或1,500×g离心10 min），取上清备用。

细胞培养物
1. 去除细胞培养基，用细胞刮刀从培养瓶刮取细胞。

2. 1,500×g离心细胞10 min，弃上清液。

3. 加300μl 1×STB，涡旋机上充分混匀，室温孵育1h并轻轻搅动。

4. 12,000×g离心1min（或1,500×g离心10 min），取上清备用。

1. 1×洗涤缓冲液
向100ml 10×洗涤缓冲液（浓缩液）中加去离子水至终体积为1000 ml。

2. 1×样品处理缓冲液（1×STB）
样品处理缓冲液必须用去离子水以1:10稀释。

检测程序
1. 准备所有试剂和样品，像下列模板例子一样记录样品位置。

2. 向CSFV抗E2单克隆抗体包被板的每个孔中加50μl稀释液。

3. 向含有稀释液的孔中加入50μl样品、阳性对照和阴性对照，最终稀释比例为1:2。

板模板例子（1-孔测试）
*S：样品；SPC：强阳性对照；WPC：弱阳性对照；NC：阴性对照。

4. 盖上盖子，37℃孵育90min或室温过夜。

5. 每个孔用1×洗涤缓冲液（每孔300μl）洗涤5次，每次洗涤需完全去除孔内液体。

6. 向每个孔中加100μl HRPO抗-CSFV连接物。

盖上盖子，37℃孵育60min。

7. 像步骤5一样，每个孔用1×洗涤缓冲液（每孔300μl）洗涤3次。

8. 向每个孔中加100μl TMB显色液。

9. 盖上盖子，室温孵育10min，肉眼观察颜色变化情况。

10. 向每个孔中加50μl终止液终止酶反应，并于450nm测定吸光值。

结果说明
A. 有效性
1. 强阳性对照的平均OD值（SPCx）应大于0.80。

2. 弱阳性对照的平均OD值（WPCx）应大于0.35。

3. 阴性对照的平均OD值（NCx）应小于0.30。

B. 判断
1. 根据下列公式计算样品的阳性百分率%SP
%SP=(样品的OD值-NCx)／(SPCx-NCx)×100
2.
3. 如果结果可疑，检查样品（是否被细菌污染等），并重新试验。

4. 如果重新试验后结果仍然可疑，那么核对畜牧场流行病学情况，重新采集猪血清进行
试验。

信息及技术协助
Jeno Biotech公司为您提供了品质与技术支持。

我们的技术服务小组由有经验的科研工作者组成。

如果你有任何关于JNKit®的问题，请联系我们。

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www. 。