3）显微注射法 借助显微注射仪，将外源DNA通过机械方法直接 注射到受体细胞。 4）基因枪法 基因枪法，也称微粒轰击法，是将DNA包被到金 粒或钨粒中然后把这些粒子加速推进靶细胞。优 点是转化受体迅速简单、取材广泛，不受基因型 限制，金属微粒的喷射面广，植株可育性高，转 化频率高等。 5）脂质体介导法 是将DNA或RNA包裹于脂质体内，然后进行脂质 体与细胞膜的融合，通过融合导入细胞。
报告基因
• 报告基因是用来筛选和指示转化细胞，组织 和转基因植物的有效标记。 • 根据报告基因编码特点，分为两类，抗性基 因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基 因或发光基因。 • 报告基因由于其表达产物易于检测，已广泛 应用于转基因植物中。
1.（一）抗性基因
一般用抗性基因来富集转化细胞。 抗性基因应满足以下几点：
2.分子生物学检测方法
1.酶联免疫吸附检测
酶联免疫吸附检测是指利用外源基 因表达蛋白的抗体与抗原的特异性，通 过结合在抗体上的酶作用于特定的底物 后发生显色反应，借助比色鉴定转基因 植物。可经免疫反应确定表达蛋白在转 基因植物组织及细胞中的分布。
植物转基因技术
转基因植物技术
• 是指利用基因工程技术，在离体条件下， 对不同生物的DNA进行加工，并按照人 们的意愿和适当的载体重新组合，再将 重载体转入受体中，并使其在体内表达 的植物。 • 转基因植物通常具有高产优质、抗病虫、 环境抗性、抗除草剂、耐储存、提高某 些成分的含量等优良性状。
1.植物转基因技术的基本路线 2.农作物基因工程（抗虫、抗 病毒﹑抗除草剂﹑转基因作物检测
无论使用哪种转基因方法，转化细 胞与非转化细胞相比都只占少数。为获 得真正的转基因植株，进行基因转化后 的第一步工作是筛选转化细胞。在含有 选择压力的培养基上诱导转化细胞分化， 形成转化芽，再诱导芽生长、生根，形 成转化植株。第二步是对转化植株进行 分子生物学鉴定。第三步则是进行性状 鉴定及外源基因的表达调控研究。
6）微激光束法 利用激光微束脉冲引起细胞膜可逆穿孔， 从而将外源DNA导入受体细胞。 7）花粉通道法
将外源DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头 或花柱，外源DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠 心进入胚囊，转化不具备细胞壁的受精卵，合子 或早期胚体细胞。
（二）农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化
人们很早就发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病， 该病在法国、东欧和意大利的葡萄和果树上曾大面积发 生。 1907年 Smith和Townsent等 首先发现这种冠瘿瘤 病是由根癌农杆菌 引发的。
1.抗性基因应是显性基因。 2.在选择压力下，转化细胞能继续生长，而非 转化细胞受到抑制，从而使转化子得到富集。 3.抗性基因产物本身不能对转化细胞的生长或 发育有抑制作用。 4.选择物价廉易得。
1.抗生素抗性基因
1.npt 新霉素磷酸转移酶基因，对卡那霉素、 巴龙霉素、新霉素具有抗性。 2.aphIV 潮霉素磷酸转移酶基因，对潮霉素 具有抗性。 3.spt 链霉素磷酸转移酶基因，对链霉素具 有抗性。 4.cat 氯霉素乙酰转移酶基因，使氯霉素丧 失抗生素活性。等等。
T-DNA 的长约 23Kb ，在其两端各有一个 25bp 左右的正向重复序列，称之为 T-DNA 的边界序列。 在不同的农杆菌 Ti 质粒上该序列高度保守，一般认 为右端重复序列对T-DNA的转移起决定性作用。
将目的基因导入植物细胞----农杆菌转化法
消毒
切取
土壤农杆 菌浸泡
叶盘
筛选培养基
愈伤组织 分化幼苗
农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化
1974年 Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分离了一种 与肿瘤诱导有关的大型质粒（大于200kb），称为Ti 质粒。 1977年Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿 瘤细胞时，用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农 杆菌 Ti 质 粒的 一 个片 段 ，称 为 T-DNA （ TransferDNA）。实验表明，T-DNA转移到植物细胞后整合 进植物基因组中并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的 发生。进一步研究发现，整合到植物基因组中的 TDNA 可以通过减数分裂稳定地传给植物的后代， Ti 质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的 重要基础。
2.抗除草剂基因
• 除草剂抗性基因在植物遗传转化中 可同时用作选择标记和培养抗除草 剂的作物。 • 抗除草剂基因主要有抗PPT的bar和 pat基因以及抗草甘膦的epsps基因。
（二）显色或发光报告基因
• • • • 1.GUS基因 2.荧光素酶基因 3.GFP基因 报告基因仅用于筛选转化体，因为报告基 因是在染色体上，只能间接证明目的基因 转入植物细胞，要获得目的基因转化及表 达的直接证据，还需要进行生物学检测。
基因表达载体的构建过程
质 粒
同一种 DNA分子 限制酶处理
一个切口 两个黏性末端
两个切口 获得目的基因 DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
三、外源基因导入植物的方法
（一）DNA直接转移法 1）化学刺激法 PEG、PNA（肽核酸）、磷酸钙、氯化 钙等化学试剂等处理原生质体，可使其捕获外 源DNA。 2）电击法 在适当的外加电压下，细胞膜可能被击穿， 使得外源DNA容易进入细胞内。原生质体不受 伤害，而且膜孔可恢复。
二、植物转基因技术的基本路线
1.目的基因的分离 2.载体构建 3.导入细菌并利用细菌繁殖扩增重组DNA 4.对植物组织或细胞进行转化 5.植株再生 6.转基因植株的鉴定 7.转基因植株的种植
(一)目的基因的获取1、从基因中获取目的基因 2、利用PCR技术扩增目的基因 3、化学方法人工合成
二.基因表达载体的构建-----------核心
农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化
Ti 质粒为根癌农杆菌核外的一种环状双链 DNA 分子，长约 200Kb 。其中含有一段称为 T-DNA 的可 转移区段，当农杆菌侵染寄主细胞后， T-DNA 可以 从农杆菌转移到寄主细胞内并整合到寄主细胞的基 因组中。 Ti 质粒的这一特性为农杆菌介导法植物转 基因奠定了基础。